Aplicando a microscopia quantitativa às pilhas vivas

insights from industryPeter BanksScientific DirectorBioTek Instruments

Nesta entrevista, Peter Banks discute as vantagens da microscopia quantitativa, e fornece o conselho em selecionar um microscópio para esta aplicação.

Por que a microscopia foi historicamente uma técnica qualitativa e como os avanços na tecnologia permitiram a microscopia de ser quantitativa?

Microscopia obtida uma longa história. Foi desenvolvida aproximadamente 350 anos há para que os cientistas visualizem coisas que poderiam distinguir, mas não as descrevam. Os dois pioneiros da microscopia eram Antoine camionete Leeuwenhoek, que desenvolveu o primeiro microscópio e logo após o cientista ilustre, Robert Hooke.

Seus microscópios ampliaram espécimes em 10-20 vezes que permitiram que visualizassem detalhes de espécimes conhecidos como piolhos acima perto pela primeira vez, mas a descoberta notável era um mundo microscópico que não conhecessem estivessem lá.

Bactérias microscópicas

Van Leeuwenhoek inventou os animálculos do termo, que representa o que nós chamaríamos as bactérias e os outros protozoa na água que a ciência não conheceu nada sobre. Com estes microscópios adiantados, podiam visualizá-los pela primeira vez.

Sobre o balanço da história de 350 anos da microscopia, foi uma técnica qualitativa. Os pesquisadores e os cientistas quiseram visualizar espécimes microscópicos e relatar o que vêem.

A microscopia quantitativa é bastante um bit diferente. Foi permitida pela era digital, e especificamente pela capacidade para digitar a luz com o uso dos transdutores como dispositivos acoplados cobrados, ou câmeras do CCD, que estam presente em quase cada câmara digital actualmente.

Estas câmeras permitem a captação da imagem em um formato digital que possa então ser processado e analisado usando programas informáticos para determinar a biologia em sua imagem.

Como pode a microscopia quantitativa ser usada para avaliar ambientes intracelulares?

Há um anfitrião das maneiras de fazer a microscopia quantitativa. Uma maneira muito comum de fazer uma experiência quantitativa com a microscopia está usando várias pontas de prova fluorescentes. Tipicamente isto começa com o uso de uma mancha nuclear. Estas são manchas químicas com uma selectividade para o ADN.

Quase todas ADN de suas pilhas' são ficadas situadas no núcleo, assim que esta mancha química manchará preferencial o núcleo, permitindo que os núcleos em sua imagem sejam identificados. Com a suposição que de uma célula tem um núcleo, esta primeira mancha permite que as pilhas em sua imagem sejam identificadas e contadas.

Então outras pontas de prova fluorescentes de cores diferentes podem ser usadas para olhar uma ou outra estruturas de pilha e/ou para determinar a função celular. Há uma grande variedade de pontas de prova fluorescentes disponíveis no comércio. Como exemplos, nós podemos usar pontas de prova fluorescentes diferentes para determinar o potencial mitocondrial da membrana, a produção de espécie reactiva do oxigênio, ou eventos da translocação da proteína.

Esta última aplicação usa caspase-3, que é activado pelo apoptosis para translocate do citoplasma ao núcleo. Nós igualmente usamos a microscopia para determinar a transcrição do biomarker do cancro do RNA com o uso da hibridação in situ fluorescente. Há tão muitas possibilidades para a microscopia quantitativa porque há uma miríade das pontas de prova diferentes disponíveis.

Que vantagens a microscopia quantitativa permite sobre microscópios tradicionais?

A microscopia quantitativa permite a biologia celular pelo fornecimento directo, pela medida quantitativa do tempo real de processos da pilha com do processamento e a análise de imagem.

Se se considera um microscópio tradicional que é um dispositivo com somente capacidades qualitativas (nenhuma processamento ou análise de imagem), a seguir as imagens notáveis podem ser adquiridas detalhando a estrutura celular, mas a medida celular da função é o melhor possível semiquantitativa. A imagem digital e a potência do computador combinam para fornecer a microscopia quantitativa.

Um exemplo do serviço público da microscopia quantitativa está na descoberta da droga usando um modelo celular que expressa um fenótipo que simule uma doença particular. Este fenótipo podia ser tão simples quanto a capacidade de uma linha celular do cancro para proliferar.

As drogas eficazes reduziriam ou parariam a proliferação destas pilhas. Este fenótipo pode ser determinado contando as pilhas no tempo real usando a microscopia.

Isto fornecerá a informação a respeito de que as drogas são activas contra o fenótipo, classificam sua capacidade para suprimir o fenótipo, determinam a cinética de drogas activas e determinam a farmacologia das drogas as mais prometedoras.

Pontas de prova fluorescentes

São as etiquetas ou as tinturas fluorescentes uma necessidade para a microscopia quantitativa?

As pontas de prova fluorescentes são muito úteis para a microscopia quantitativa e muitos foram desenvolvidos para fixado e vivem ensaios da pilha. os métodos Etiqueta-livres podem igualmente ser usados para a microscopia quantitativa e este é particularmente benéfico para a imagem lactente viva da pilha.

BioTek tem um número de métodos para executar a microscopia quantitativa etiqueta-livre, sem o uso de pontas de prova fluorescentes. O canal do brightfield, que monitora a capacidade de um espécime para absorver a luz branca é um formulário da microscopia etiqueta-livre. Nós usamos este formulário da microscopia para medir os % da afluência das pilhas em um microplate bom e em ensaios da invasão do tumor.

BioTek igualmente tem um método proprietário para aumentar o contraste de nosso canal do brightfield que permite a contagem de células etiqueta-livre para aplicações como a proliferação de pilha, por exemplo. Além, alguns de nossos instrumentos possuem um canal do contraste da fase de microscopia, que utiliza a refracção da luz através da amostra para o realce do contraste. Isto foi usado para o apoptosis de determinação com da medição da redondeza das pilhas.

Que microscópios fazem fonte de BioTek para a microscopia quantitativa?

Os microscópios de BioTek fornecem a microscopia digital automatizada do widefield. Pelo automatizado, eu significo que captação, processamento e análise da imagem pode tudo ser executada pelo instrumento com os parâmetros de pré-ajuste entrados pelo operador.

Nossos microscópios envolvem um tipo de geometria, que usa invertida, projecto epifluorescent. Os modos de microscopia disponíveis incluem a fluorescência, o brightfield, o brightfield do contraste alto, o brightfield da cor e o contraste da fase.

Como Cytation 3, Cytation 5 e Lionheart FX diferem? Que tipo de pesquisador cada microscópio é projectado para?

A revelação destes instrumentos foi baseada originalmente em nosso conhecimento de nossos mercados naquele tempo. Nós fomos uma empresa da instrumentação do microplate por mais de 30 anos assim que o primeiro produto que nós tivemos na microscopia foi baseado no projecto de um de nossos leitores mais populares do microplate em que nós adicionamos invertida, microscópio projetado epifluorescence.

Assim nossos clientes poderiam executar todas suas aplicações típicas do leitor do microplate, como ELISAs, proteína, de gene do ADN e do repórter ensaios, mas agora igualmente fazem a microscopia do widefield do brightfield e da fluorescência. Este primeiro produto era o Cytation 3 que foi lançado em abril de 2013.

Durante os próximos três anos, nós expandimos o número de modos da microscopia disponíveis para incluir o brightfield do contraste alto e no Cytation 5, no brightfield da cor e no contraste da fase.

Durante este período, nós igualmente aumentamos significativamente nossas capacidades na microscopia quantitativa continuamente desenvolvendo o processamento de imagem novo e as ferramentas de análise.

Lionheart FX é nosso produto mais novo e um tanto diferente dos produtos de Cytation naquele não há nenhum sistema ótico tradicional do leitor do microplate no instrumento, ele foi projectado para o microscopist que quer fazer a imagem lactente viva da pilha.

A imagem lactente fixa da pilha pode ainda ser executada, mas todos os aspectos ambiental e de umidade do controle desse instrumento foram projectados permitir experiências cinéticas a longo prazo usando a microscopia. Além disso, a microscopia de alta resolução excelente pode ser executada em Lionheart com objetivos do microscópio da imersão do petróleo 60x e o 100x.

Lionheart FX

Apoio vivo cinético do ensaio da pilha de Lionheart FX. A tampa do controle ambiental contem a temperatura e o gás. A câmara da umidade apoia a cinética viva da pilha do prazo. Os injectores duplos do reagente fornecem rapidamente injectam/imagens para observar reacções rápidas

Podem todos seus microscópios quantitativos ser usadas para a imagem lactente viva da pilha? Ou apenas o Lionheart FX?

Todos os três podem ser usados para a imagem lactente viva da pilha. O Cytation 3 e 5 tem um controlador acessório do gás que mantenha o CO2 e os níveis2 de O directamente na câmara da detecção do instrumento, que está igualmente a uma temperatura controlada.

Isto é útil para experiências cinéticas de um termo mais curto usando pilhas vivas. Não há nenhum controle de umidade no Cytation 3 ou em Cytation 5 assim que para experiências cinéticas a longo prazo nós recomendamos o uso de nossa incubadora automatizada de BioSpa 82 CO que guardara pelo menos oito (8) partes de labware.

O BioSpa entrega microplates ou o outro labware ao Cytation 3 ou 5 e retorna-os à incubadora uma vez que uma leitura é feita através de um braço robótico.

Além, o BioSpa 8 igualmente monitora as circunstâncias ambientais e grava os dados. Esta união dos instrumentos é parte de nosso sistema de BioSpa para ensaios cinéticos a longo prazo com pilhas vivas.

O Lionheart FX é um instrumento independente que controle a temperatura, o CO2 e os níveis2 de O, e umidade directamente. O Lionheart é mais para o microscopist tradicional que quer no máximo fazer uma placa de cada vez.

Que tipo de eventos celulares pode ser observado desta maneira?

Os eventos celulares do tempo real em pilhas vivas podem ser classificados pelo comprimento das experiências cinéticas que estão sendo conduzidas. As experiências cinéticas a longo prazo investigam pilhas durante dias a uma semana ou a dois. Por exemplo os estudos da proliferação de pilha usados na pesquisa da oncologia, exigem tipicamente até uma semana para terminar.

As variações na proliferação de pilha seriam a pesquisa da citotoxidade, onde as drogas são adicionadas para tentar e inibir a proliferação de pilha. Os ensaios curas do risco ou da ferida são igualmente aplicações comuns. Estes estudos podem durar em torno de um dia a diversos dias segundo as capacidades da migração das pilhas que particulares você está interessado dentro.

Os ensaios da invasão do tumor igualmente podem exigir diversos dias para terminar. Nestes ensaios, pilhas agregadas em um esferóide e cercadas pela indicação do matrigel in vivo a condição de um tumor em tecido circunvizinho. A taxa que as pilhas do esferóide invadem em um media biológico circunvizinho é determinada.

Inversamente, as experiências cinéticas da pilha viva a curto prazo duram actas um pouco do que dias. Estes ensaios investigam a função celular rápida. Por exemplo, a imagem lactente do cálcio mede o fluxo do tempo real do íon do cálcio induzido pela activação do receptor.

Este fluxo aumenta e quedas tipicamente durante aproximadamente uma acta. Com imagem lactente, nós podemos determinar como as pilhas individuais respondem diferentemente à activação do receptor. Isto é evidente no valor e na cinética da produção2+ do Ca.

Nós igualmente medimos a cinética de segundos mensageiros em GPCR que sinaliza, uma família altamente druggable do gene. GPCRs esclarece ao redor 60% de todas as drogas conhecidas, fazendo as estudadas altamente por companhias farmacéuticas. Estes segundos mensageiros igualmente têm as cinéticas rápidas que são gastadas tipicamente na escala minúscula.

Estes ensaios usados genetically codificaram a tecnologia fluorescente da proteína que ou aumentaram ou a fluorescência diminuída baseou na presença destes segundos mensageiros. Isto igualmente permite que você multiplexe a detecção destes segundos mensageiros: por exemplo, nós multiplexamos um acampamento com um biosensor do diacylglycerol. Aquela é uma aplicação biológica quantitativa realmente agradável.

Assim com todos nossos instrumentos, nós podemos fazer experiências cinéticas a curto prazo e a longo prazo em pilhas vivas.

Você fornece o software de processamento de imagem que pode ser usado com seus microscópios?

Eu quero começar fazendo uma diferença entre o processamento da imagem lactente e a análise da imagem lactente. A minha mente, o processamento da imagem lactente envolve a redução, o alisamento, a costura de uma montagem das imagens junto ou a tomada do fundo de uma Z-pilha e de uma projecção com a biologia grossa.

Inversamente, a análise de imagem usa vários algoritmos para determinar a biologia após ter adquirido e ter processado essa imagem. Nós temos dois níveis diferentes de software de análise da imagem para cumprir exigências específicas da análise.

Gen5 Image+ permite que você execute umas aplicações mais simples como a contagem das pilhas, medindo a eficiência do transfection de GFP, por exemplo ou determinando % da afluência.

Gen5 Image+

A prima da imagem Gen5, contem um pacote muito mais sofisticado de ferramentas de análise da imagem que permita realmente aplicações quantitativas na microscopia. Estas aplicações incluem a translocação nuclear, a hibridação in situ fluorescente, os estudos da co-localização, e a análise do ciclo de pilha, entre outros.

Prima da imagem Gen5

Onde você vê o sentido da microscopia quantitativa se mover no futuro? Em termos da melhoria no software da imagem lactente e na automatização da microscopia?

Eu penso que BioTek está estabelecido agora como um líder na microscopia quantitativa automatizada. Nós continuaremos a promover esta reputação enquanto nós construímos para fora nossas capacidades em simplificar a microscopia com a automatização e em aumentar as capacidades fenotípicas do ensaio que a prima da imagem permite.

Uma área onde eu penso que a microscopia quantitativa automatizada pode ser extremamente benéfica é aplicada aos métodos da cultura celular 3D. Os cientistas estão movendo longe da imagem lactente um a camada de 2D pilhas chapeadas, se em um poço da corrediça ou do microplate do microscópio.

A pesquisa extensiva está sendo executada com as estruturas como hydrogels, esferóides, tecidos e órgão em dispositivos da microplaqueta. Eu penso que a microscopia quantitativa automatizada pode melhor permitir estes tipos physiologically relevantes de ensaios, onde a amostra da experiência se assemelha mais pròxima ao que está indo sobre em seres humanos.

Onde podem nossos leitores encontrar mais sobre BioTek e seus microscópios quantitativos?

https://www.cellimager.com/

https://www.biotek.com/

Sobre Peter Banks

Peter Banks

Peter Banks é o director científico em instrumentos de BioTek, Inc. Suas responsabilidades incluem a gestão das aplicações da empresa team e fornecendo a orientação científica à equipe de alta administração na nova tecnologia e nas tendências emergentes que impactam o mercado do microplate e a seus mercados periféricos da manipulação e da detecção do líquido.

Antes de juntar-se BioTek em 2008, os bancos foram empregados em um número de papéis dentro de PerkinElmer por uma década. Estes papéis incluíram a gestão do programa de R&D do BioPharma de PerkinElmer e o director da farmacologia molecular para o biosinal de PerkinElmer em Montreal, Canadá, centrando-se sobre a revelação de tecnologias da detecção e de sistemas numerosos do reagente para a selecção alta da produção.

Antes das experiências em PerkinElmer e em BioTek, os bancos eram um professor adjunto na química analítica na universidade de Concordia, Montreal, Canadá desde 1994 até 1998. Os bancos foram concedidos uma bolsa de estudo cargo-doutoral de NSERC em 1993 depois de sua dissertação para o PhD na universidade do Columbia Britânica em 1992.

Citations

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