Aplicación de microscopia cuantitativa a las células vivas

insights from industryPeter BanksScientific DirectorBioTek Instruments

En esta entrevista, Peter Banks discute las ventajas de la microscopia cuantitativa, y asesora en la selección de un microscopio para este uso.

¿Por qué la microscopia ha sido históricamente una técnica cualitativa y cómo los avances en tecnología han permitido a microscopia ser cuantitativa?

Microscopia conseguida una larga historia. Fue desarrollada hace aproximadamente 350 años para que a los científicos visualicen cosas que podrían discernir, pero no las describan. Los dos pioneros de la microscopia eran Antoine van Leeuwenhoek, que desarrolló el primer microscopio y pronto después del científico renombrado, Robert Hooke.

Sus microscopios magnificaron especímenes por 10-20 veces que permitieron que visualizaran a los detalles de especímenes conocidos como piojos hacia arriba cerca por primera vez, pero el descubrimiento notable era un mundo microscópico que no conocían estaban allí.

Bacterias microscópicas

Van Leeuwenhoek acuñó los animálculos del término, que representa lo que llamaríamos bacterias y otros protozoos en el agua sobre la cual la ciencia no conocía nada. Con estos microscopios tempranos, podían visualizarlos por primera vez.

Sobre el equilibrio de la historia de 350 años de la microscopia, ha sido una técnica cualitativa. Los investigadores y los científicos quisieron visualizar especímenes microscópicos y denunciar lo que ven.

La microscopia cuantitativa es muy una broca diferente. Ha sido habilitada por la era digital, y específicamente por la capacidad de digitalizar la luz con el uso de transductores como los dispositivos acoplados cargados, o las cámaras CCD, que están presentes en casi cada cámara digital actualmente.

Estas cámaras permiten captura de la imagen en un formato digital que se pueda después tramitar y analizar usando programas de computadora para cuantificar la biología en su imagen.

¿Cómo se puede la microscopia cuantitativa utilizar para fijar ambientes intracelulares?

Hay un ordenador principal de maneras de hacer microscopia cuantitativa. Una manera muy común de hacer un experimento cuantitativo con microscopia está utilizando diversas antenas fluorescentes. Esto comienza típicamente con el uso de una mancha de óxido nuclear. Éstas son manchas de óxido químicas con una selectividad para la DNA.

Casi todas DNA de sus células' están situadas en el núcleo, así que esta mancha de óxido química manchará preferencial el núcleo, permitiendo que los núcleos en su imagen sean determinados. Con la suposición que una célula tiene un núcleo, esta primera mancha de óxido permite que cuentaas las células en su imagen sean determinadas y.

Entonces otras antenas fluorescentes de diversos colores se pueden utilizar para observar cualquier estructuras de célula y/o para cuantificar la función celular. Hay una amplia variedad de antenas fluorescentes disponibles en el comercio. Como ejemplos, podemos utilizar diversas antenas fluorescentes para cuantificar potencial mitocondrial de la membrana, la producción de especie reactiva del oxígeno, o acciones del desplazamiento de la proteína.

Este último uso utiliza caspase-3, que es activado por apoptosis para desplazar del citoplasma al núcleo. También hemos utilizado microscopia para cuantificar la transcripción del biomarker del cáncer del ARN con el uso del hibridación "in-situ" fluorescente. Hay tan muchas posibilidades de la microscopia cuantitativa porque hay una miríada de diversas antenas disponibles.

¿Qué ventajas la microscopia cuantitativa permite sobre los microscopios tradicionales?

La microscopia cuantitativa habilita biología celular ofreciendo la medición cuantitativa directa, en tiempo real de los procesos de la célula con el tratamiento y el análisis de la imagen.

Si uno considera un microscopio tradicional que es un dispositivo con solamente capacidades cualitativas (ningún tratamiento o análisis de la imagen), después las imágenes notables se pueden detectar detallando la estructura celular, pero la medición celular de la función es en el mejor de los casos semiquantitativa. La imagen digital y la potencia de la computador combinan para ofrecer microscopia cuantitativa.

Un ejemplo de la utilidad de la microscopia cuantitativa está en descubrimiento de la droga usando un modelo celular que expresa un fenotipo que simule una enfermedad determinada. Este fenotipo podía ser tan simple como la capacidad de una variedad de células del cáncer de proliferar.

Las drogas efectivas reducirían o pararían la proliferación de estas células. Este fenotipo puede ser cuantificado contando las células en tiempo real usando microscopia.

Esto ofrecerá la información referente que las drogas son activas contra el fenotipo, alinean su capacidad de suprimir el fenotipo, determinan la cinética de drogas activas y cuantifican la farmacología de las drogas más prometedoras.

Antenas fluorescentes

¿Son las etiquetas o los tintes fluorescentes una necesidad para la microscopia cuantitativa?

Las antenas fluorescentes son muy útiles para la microscopia cuantitativa y muchos se han desarrollado para reparado y viven los análisis de la célula. los métodos Escritura de la etiqueta-libres se pueden también utilizar para la microscopia cuantitativa y esto es determinado beneficioso para la proyección de imagen viva de la célula.

BioTek tiene varios métodos para realizar microscopia cuantitativa escritura de la etiqueta-libre, sin el uso de antenas fluorescentes. El canal del brightfield, que vigila la capacidad de un espécimen de absorber la luz blanca es una forma de microscopia escritura de la etiqueta-libre. Hemos utilizado esta forma de la microscopia para medir los % de la confluencia de células en un microplate bien y en análisis de la invasión del tumor.

BioTek también tiene un método propietario para aumentar el contraste de nuestro canal del brightfield que permita la numeración celular escritura de la etiqueta-libre para los usos como la proliferación de célula, por ejemplo. Además, algunos de nuestros instrumentos poseen un canal del contraste de la fase de la microscopia, que utiliza la refracción de la luz a través de la muestra para el aumento del contraste. Esto se ha utilizado para el apoptosis de cuantificación con la medición de la redondez de células.

¿Qué microscopios hacen abastecimiento de BioTek para la microscopia cuantitativa?

Los microscopios de BioTek ofrecen microscopia digital automatizada del widefield. Por automatizado, significo que captura, tramitación y análisis de la imagen se puede todos realizar por el instrumento con los parámetros de precolocación entrados por el operador.

Nuestros microscopios implican un tipo de geometría, que utiliza haber invertido, diseño epifluorescent. Las maneras de la microscopia disponibles incluyen fluorescencia, el brightfield, el brightfield del alto contraste, el brightfield del color y el contraste de la fase.

¿Cómo Cytation 3, Cytation 5 y Lionheart FX difieren? ¿Para qué tipo de investigador cada microscopio se diseña?

El revelado de estos instrumentos fue basado originalmente en nuestro conocimiento de nuestros mercados en ese entonces. Hemos sido una compañía de la instrumentación del microplate por más de 30 años así que el primer producto que teníamos en microscopia fue basado en el diseño de uno de nuestros programas de lectura más populares del microplate en los cuales agregamos haber invertido, microscopio diseñado epifluorescence.

Así nuestros clientes podrían realizar todos sus usos típicos del programa de lectura del microplate, como ELISAs, proteína, los análisis del gen de la DNA y del reportero, pero ahora también hacen microscopia del widefield del brightfield y de la fluorescencia. Este primer producto era el Cytation 3 que fue lanzado en abril de 2013.

Durante los tres años próximos, desplegamos el número de maneras de la microscopia disponibles para incluir el brightfield del alto contraste y en el Cytation 5, el brightfield del color y el contraste de la fase.

Durante este período, también aumentamos importante nuestras capacidades en microscopia cuantitativa contínuo desarrollando el nuevo tratamiento de la imagen y las herramientas de análisis.

Lionheart FX es nuestro producto más nuevo y algo diferente de los productos de Cytation en eso no hay las ópticas tradicionales del programa de lectura del microplate en el instrumento, él se ha diseñado para el microscopista que quiere hacer proyección de imagen viva de la célula.

La proyección de imagen fija de la célula puede todavía ser realizada, pero todos los aspectos del mando ambiental y de humedad de ese instrumento se han diseñado para habilitar experimentos cinéticos a largo plazo usando microscopia. Además, la microscopia de alta resolución exquisita se puede realizar en Lionheart con los objetivos de immersión en aceite del microscopio 60x y 100x.

Lionheart FX

Apoyo vivo cinético del análisis de la célula de Lionheart FX. La tapa del control del medio ambiente contiene temperatura y el gas. La cinética viva de la célula del largo plazo de los apoyos de la cámara de la humedad. Los inyectores dobles del reactivo ofrecen aprisa inyectan/imagen para observar reacciones rápidas

¿Se pueden todos sus microscopios cuantitativos utilizar para la proyección de imagen viva de la célula? ¿O apenas el Lionheart FX?

Los tres se pueden utilizar para la proyección de imagen viva de la célula. El Cytation 3 y 5 tiene un controlador aéreo accesorio del gas que mantenga el CO2 y niveles2 de O directamente en la cámara de la detección del instrumento, que es también de temperatura controlada.

Esto es útil para los experimentos cinéticos más a corto plazo usando las células vivas. No hay mando de humedad en el Cytation 3 o Cytation 5 así que para los experimentos cinéticos a largo plazo recomendamos el uso de nuestra incubadora automatizada de BioSpa 82 CO que lleve a cabo por lo menos ocho (8) pedazos de labware.

El BioSpa entrega los microplates o el otro labware al Cytation 3 o 5 y los vuelve a la incubadora una vez que una lectura se hace vía una arma robótica.

Además, el BioSpa 8 también vigila las condiciones ambientales y registra los datos. Este matrimonio de instrumentos es parte de nuestro sistema de BioSpa para los análisis cinéticos a largo plazo con las células vivas.

El Lionheart FX es un instrumento independiente que controla la temperatura, el CO2 y los niveles2 de O, y humedad directamente. El Lionheart es más para el microscopista tradicional que a lo más quiere hacer una placa al mismo tiempo.

¿Qué tipo de acciones celulares se puede observar de esta manera?

Las acciones celulares en tiempo real en células vivas se pueden clasificación por el largo de los experimentos cinéticos conducto. Los experimentos cinéticos a largo plazo investigan las células durante días a una semana o a dos. Por ejemplo los estudios de la proliferación de célula usados en la investigación de la oncología, requieren típicamente hasta una semana para terminar.

Las variaciones en la proliferación de célula serían la investigación de la citotoxicidad, donde las drogas se agregan para intentar y para inhibir la proliferación de célula. Los análisis curativos de la rayadura o de la herida son también usos comunes. Estos estudios pueden durar a partir alrededor de un día a varios días dependiendo de las capacidades de la migración de las células determinadas que usted está interesado hacia adentro.

Los análisis de la invasión del tumor también pueden requerir varios días para terminar. En estos análisis, células agregadas en un esferoide y rodeadas por el imitador del matrigel la condición in vivo de un tumor en tejido circundante. Se cuantifica el régimen que las células del esferoide invaden en un ambiente biológico circundante.

Inversamente, los experimentos cinéticos de la célula viva a corto plazo duran minutos bastante que días. Estos análisis investigan la función celular rápida. Por ejemplo, la proyección de imagen del calcio mide el fundente en tiempo real del ión del calcio inducido por la activación del receptor.

Este fundente sube y las caídas típicamente durante alrededor de un minuto. Con proyección de imagen, podemos determinar cómo las células individuales responden diferentemente a la activación del receptor. Esto es evidente en la magnitud y la cinética de la producción2+ del Ca.

También hemos medido la cinética de los segundos mensajeros en GPCR que hacía señales, una familia altamente druggable del gen. GPCRs explica el alrededor 60% de todas las drogas sabidas, haciéndolas estudiadas altamente por las compañías farmacéuticas. Estos segundos mensajeros también tienen cinéticas rápidas que estén pasadas típicamente en el alcance minucioso.

Estos análisis usados genético codificaron tecnología fluorescente de la proteína que o han aumentado o la fluorescencia disminuida ha basado en la presencia de estos segundos mensajeros. Esto también permite que usted multiplexe la detección de estos segundos mensajeros: por ejemplo, hemos multiplexado un campamento con un biosensor del diacylglycerol. Eso es un uso biológico cuantitativo realmente agradable.

Tan con todos nuestros instrumentos, podemos hacer experimentos cinéticos a corto plazo y a largo plazo en las células vivas.

¿Usted ofrece el software de tratamiento de la imagen que se puede utilizar con sus microscopios?

Quiero comenzar diferenciando entre el tramitación de la proyección de imagen y el análisis de la proyección de imagen. A mi mente, el tramitación de la proyección de imagen implica la reducción, alisar, la costura de un montaje de imágenes junto o tomar del fondo una Z-pila y una proyección con biología gruesa.

Inversamente, el análisis de imagen utiliza diversos algoritmos para cuantificar biología después de detectar y de tramitar esa imagen. Tenemos dos diversos niveles de software de análisis de imagen para cumplir requisitos específicos del análisis.

Gen5 Image+ permite que usted realice usos más simples como contar las células, midiendo la eficiencia de la transfección de GFP, por ejemplo o determinando % de la confluencia.

Gen5 Image+

La prima de la imagen Gen5, contiene un empaquetar mucho más sofisticado de las herramientas de análisis de imagen que habilite realmente usos cuantitativos en microscopia. Estos usos incluyen el desplazamiento nuclear, el hibridación "in-situ" fluorescente, estudios de la co-localización, y análisis del ciclo celular, entre otros.

Prima de la imagen Gen5

¿Dónde usted ve la dirección de la microscopia cuantitativa el moverse en el futuro? ¿En términos de mejoría en el software de la proyección de imagen y en la automatización de la microscopia?

Pienso que BioTek ahora está establecido como líder en microscopia cuantitativa automatizada. Continuaremos fomentar esta reputación mientras que creamos nuestras capacidades en la simplificaión de microscopia con la automatización y el aumento de las capacidades fenotípicas del análisis que la prima de la imagen habilita.

Una área donde pienso que la microscopia cuantitativa automatizada puede ser extremadamente beneficiosa se aplica a los métodos del cultivo celular 3D. Los científicos están moviendo lejos de proyección de imagen a la capa de las 2.as células chapadas, si en un pozo de la diapositiva o del microplate del microscopio.

La investigación extensa se está realizando con las estructuras como hidrogeles, esferoides, tejidos y órgano sobre los dispositivos de la viruta. Pienso que la microscopia cuantitativa automatizada puede habilitar mejor estos tipos fisiológico relevantes de análisis, donde la muestra del experimento se asemeja más de cerca a lo que está entrando conectado en seres humanos.

¿Dónde pueden nuestros programas de lectura descubrir más sobre BioTek y sus microscopios cuantitativos?

https://www.cellimager.com/

https://www.biotek.com/

Sobre Peter Banks

Peter Banks

Peter Banks es el director científico en BioTek Instruments, Inc. que sus responsabilidades incluyen la administración de los usos de la compañía team y ofreciendo la dirección científica a las personas de administración superior en nueva tecnología y tendencias emergentes que afectan el mercado del microplate y a sus mercados periféricos del manejo y de la detección del líquido.

Antes de ensamblar BioTek en 2008, las inclinaciones laterales fueron empleadas en varios papeles dentro de PerkinElmer por una década. Estos papeles incluyeron la administración del programa de R&D de BioPharma de PerkinElmer y al director de la farmacología molecular para la bioseñal de PerkinElmer en Montreal, Canadá, centrándose en el revelado de las tecnologías de la detección y de los sistemas numerosos del reactivo para la alta investigación de la producción.

Antes de experiencias en PerkinElmer y BioTek, las inclinaciones laterales eran profesor adjunto en química analítica en la universidad de Concordia, Montreal, Canadá a partir de 1994 a 1998. Las inclinaciones laterales fueron concedidas una beca postdoctoral de NSERC en 1993 después de su disertación para el doctorado en la universidad de la Columbia Británica en 1992.

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