Dépistage unique de molécule des protéines dans les cellules

Une entrevue avec professeur David Walt, université de touffes, a conduit avant avril Cashin-Garbutt, MAMANS (Cantab)

Pouvez-vous s'il vous plaît vous donner à une introduction au choix unique de molécule (Simoa) s'être développé et cela que vous discuterez dans votre entretien chez Pittcon 2017 ?

Nous avons développé cette technologie il y a presque 10 ans. Elle a été développée après qu'une expérience principale ait été effectuée par David Rissin, qui était un candidat de PhD dans mon laboratoire alors.

Lorsque, nous travaillions avec des choix de microwell pour un projet différent. À un contact de laboratoire j'ai posé la question : « Combien de molécules d'une molécule fluorescente elle prendrait pour porter la concentration dans un de ces microwells très minuscules à un niveau qui serait facilement détectable ? » Nous avons effectué le calcul et il s'est avéré être environ 100 molécules d'une teinture fluorescente.

David a effectué une expérience utilisant un choix de microwell de fibre optique, qui a eu approximativement 60.000 microwells sur l'extrémité d'une fibre optique. Nous avons enfermé une solution très diluée d'une enzyme dans les ces microwells-chaque microwell avons eu un volume de la commande de 40 femtoliters (10-15 litres) - un volume très minuscule.

Pittcon Simoa

L'expérience a été conçue pour enfermer une solution très diluée d'une enzyme contenant une forte concentration d'un substrat. Les substrats sont les produits de départ pour des enzymes, telles que s'il y avait un présent d'enzymes, l'enzyme catalyserait la conversion de ce substrat dans beaucoup de molécules d'un produit fluorescent. Ce procédé se produirait bien rapidement avec de la β-galactosidase, qui est une enzyme assez active.

L'idée était que nous ferions fonctionner cette réaction à une concentration si diluée d'enzyme que seulement une fraction des puits contiendrait une molécule d'enzymes et seulement ces puits qui ont faite produiraient par fluorescence. Après David que Rissin a établi les petits groupes techniques requis d'effectuer l'expérience, il a expliqué qu'on pourrait clairement voir quels puits ont contenu une molécule d'enzymes parce qu'ils ont tourné très le rouge vif contrairement aux puits qui n'ont contenu aucune molécule d'enzymes, qui est restée noire.

Après cette démonstration, nous avons observé que pendant que nous diminuions la concentration en enzymes, nous avons observé moins puits fluorescents parce qu'il y avait moins molécules d'enzymes dans le choix. Nous publiés un papier dans les lettres nanoes et prétendu que c'était la première fois que n'importe qui avait mesuré la concentration en comptant des molécules.

Ainsi cette expérience était la première démonstration que vous pourriez prendre une solution, la logent dans les volumes très minuscules et comptent littéralement le nombre de molécules actuelles dans cette solution. Dans ce cas, la concentration en β-galactosidase a pu être mesurée en comptant simplement le nombre de puits lumineux relativement au nombre de puits foncés.

Choix moléculaires uniques

Simoa a été développé parce que nous nous sommes demandés si nous pourrions employer cette approche pour mesurer réellement les choses dont les gens se sont inquiétés. Par exemple, les biologistes sont particulièrement intéressés par les molécules de mesure telles que les acides nucléiques et les protéines.

Au fil du temps, la technologie unique de choix de molécule développée où des réactifs obligatoires sont maintenant fixés aux microsphères ou aux talons de `' afin de capter les molécules-cible d'intérêt de la solution. Les talons contenant les molécules-cible attachées sont alors marqués avec une molécule d'enzymes et chargé dans les puits et les puits sont scellés.

S'il y a une molécule d'enzymes fixée à un talon, il agit en tant que journaliste pour la molécule d'acide nucléique ou la molécule de protéine d'intérêt. La molécule jointe d'enzymes catalyse la conversion de beaucoup de molécules de substrat dans le produit tels que les puits contenant l'enzyme accumuleront localement une forte concentration de produit et brilleront par fluorescence. Les puits ne contenant les talons mais aucune molécule attachée resteront foncés. C'est l'évolution entière de la technologie.

Combien sensible est Simoa à trouver des protéines et des acides nucléiques ?

En ce qui concerne les acides nucléiques, il est près d'autres techniques sensibles telles que l'amplification en chaîne par polymérase (PCR). Par exemple, il y a eu des démonstrations où une séquence particulière d'acide nucléique peut être trouvée (10) à la concentration-15 femtomolar ainsi la sensibilité peut même être plus élevée que celle.

Il en va de même pour des protéines où la limite de Simoa du dépistage est type au sujet d'un facteur 100 à 1000 fois plus sensible que la méthode traditionnelle d'exécuter une technique de la méthode ELISA d'analyse-le de protéine (ELISA). La technologie de Simoa ouvrent le potentiel pour pouvoir mesurer des protéines aux concentrations qui jamais n'ont été trouvées avant dans genres variés d'échantillons comprenant le sang, qui est l'orientation principale pour des analyses basées sur Simoa.

Pouvez-vous s'il vous plaît expliquer comment vous vous êtes appliqué la méthode à l'analyse des cellules cancéreuses cultivées ?

Nous avons simplement changé traiter et préparation témoin de sorte qu'elle puisse être appliquée à une analyse unicellulaire. C'est toujours une analyse conventionnelle de Simoa qui emploie des anticorps de saisie fixés aux talons afin de gripper des protéines d'intérêt pour différentes cellules.

Pour la préparation des échantillons, nous isolons d'abord différentes cellules, manuellement ou avec un grand choix de procédures unicellulaires d'isolement telles que la cytométrie de flux ou le microfluidics. La clavette est d'isoler différentes cellules en volumes très petits.

Nous alors prenons les cellules d'isolement et les lysons pour perturber leurs membranes et pour décharger leurs teneurs dans un petit volume de tampon. Nous alors ajoutons des talons et captons les molécules que nous sommes intéressés à trouver. Tout suit alors le flux de travail conventionnel pour Simoa.

L'objectif est de pouvoir étudier différentes cellules dans une population. On l'identifie maintenant que homogénéisant une population des cellules, type millions de milliers sinon de cellules, quand effectuer une mesure donne une concentration moyenne de la protéine ou de l'acide nucléique qui est dans les cellules. De telles mesures masquent l'hétérogénéité de la population cellulaire.

Utilisant Simoa nous pouvons mesurer les concentrations protéiques en différentes cellules cancéreuses. Observer des centaines de cellules à la fois au niveau unicellulaire fournit l'analyse dans l'hétérogénéité de la population cellulaire. En développant une technologie qui peut mesurer les concentrations protéiques en différentes cellules, nous pouvons regarder la distribution des concentrations protéiques dans la population.

Une utilisation possible une telle technologie serait dans un réglage clinique pour étudier des biopsies de tissu. Par exemple, si on prenait une biopsie à l'aiguille d'une femme qui a eu une mammographie anormale, les différentes cellules pourraient alors être dissociées de ce tissu de biopsie et s'analyser, par opposition à regarder la moyenne de population.

Cette approche est importante parce que s'il y avait des cellules rares dans l'échantillon qui s'est avéré justement avoir un phénotype particulièrement agressif, même un sur 1.000 ou un sur 10.000 cellules dans ce prélèvement de tissu, il serait difficile de trouver cette cellule si vous deviez homogénéiser le tissu d'abord et regardiez seulement la moyenne de la population cellulaire. Cette cellule agressive particulièrement rare va se diviser rapidement et pourrait finir mener à la maladie métastatique et éventuel à des résultats faibles pour le patient.

Quand les pathologistes évaluent des échantillons de biopsie, ils regardent la population cellulaire générale et ils n'obtiennent pas le niveau de la granularité qui est nécessaire pour déterminer s'il y a un présent rare particulièrement agressif de cellules qui donnera au patient un mauvais pronostic. En regardant la moyenne, vous pourriez conclure, « bien, 9.999 cellules sont normales » parce que cette 10,000th cellule rare est ramenée à une moyenne dans les résultats et les résultats sont pour cette raison polarisés en faveur de la moyenne de population.

Queest-ce que d'autres applications de Simoa sont là ?

Il y a une grande variété d'indications cliniques étant vérifiées. Cette technologie a été maintenant commercialisée par la compagnie de Quanterix-a basée dans le Massachusetts dont je suis le fondateur scientifique. Ils ont qualifié les brevets qui sont sortis de mon laboratoire de touffes et commercialisent la technologie.

Mon laboratoire a été concentré principalement sur le dépistage de cancer du sein et de maladie infectieuse. Nous commençons maintenant à regarder la maladie de Parkinson utilisant la technologie. D'autres chercheurs regardent les maladies inflammatoires variées. Il y a également une communauté assez considérable qui emploie la technologie pour regarder des troubles neurologiques ; en particulier, les choses aiment la lésion cérébrale traumatique.

La Ligue nationale du football aux USA a financé une partie de la recherche qui regarde des bornes relâchées du cerveau quand le cerveau remarque une lésion traumatique. Ces protéines sont relâchées et semblent dans la circulation sanguine, et semblent être hautement prévisionnelles de l'ampleur du traumatisme de cerveau.

D'autres chercheurs ont employé la technologie de Simoa pour commencer à regarder des marqueurs sanguins pour la maladie d'Alzheimer. Encore d'autres emploient Simoa pour trouver des premiers signes de crises cardiaques, en mesurant certaines protéines qui sont relâchées dans les stades précoces quand le coeur commence à avoir des éditions.

Que les membres de public apprendront-ils de votre entretien chez Pittcon 2017 ?

Chez Pittcon je parlerai au sujet de certains des détails techniques de la préparation des échantillons pour obtenir des cellules d'isolement pour effectuer des mesures biologiques signicatives.

Je présenterai également une partie de notre dernier travail avec les cellules cancéreuses cultivées variées où nous avons pu multiplexer les analyses et je montrerai quelques mesures signicatives qui indiquent que nous avons une bonne possibilité de trouver les cellules rares quand nous nous appliquons cette technologie aux échantillons cliniques.

Quel Pittcon peut faire pour vous d'AZoNetwork sur Vimeo.

Quel choc pensez-vous Simoa avez-vous à l'avenir quant à trouver les cellules rares ?

J'ai déjà mentionné le dépistage des cellules rares agressives dans des biopsies de tissu dans un réglage clinique mais il y a également une composante de recherches en plus de la composante clinique.

Dans un cadre de recherches, est de notre point de vue une des questions intéressantes à ce que faites ces cellules rares ressemblent ? Comment diffèrent-elles de la moyenne de population ? Il y est eu beaucoup d'effort dans la génomique unicellulaire en raison de la large variété de technologies génétiques, y compris l'ordonnancement, qui sont maintenant procurables. En raison de ces technologies, il y a la capacité pour isoler différentes cellules, les étiquette et puis les regarde comment la génétique diffère de la cellule à la cellule.

Naturellement, cela nous donne de l'analyse intéressante dans la variabilité de cellule-à-cellule est-ce que mais une des choses que les gens sont extrêmement intéressés dedans est comment faites ces altérations génétiques manifestes en termes de la façon dont la cellule exprime différentes protéines et la façon dont la cellule diffère réellement de ses cellules environnantes ?

De nouveau, est l'obtention du génotype au phénotype est un endroit beaucoup moins exploré, et ce qui mon laboratoire est sur-essai orienté de comprendre combien grandes sont ces différences entre les cellules. Si nous pouvons maintenant combiner les deux technologies et marquer le génotype-le génétique différence-avec les protéines de voie de phénotype-le sont exprimés et l'apparence matérielle de la cellule-alors nous allons avoir bien mieux une compréhension de la façon dont les cellules rares ont la capacité de faire les choses que la plupart des autres cellules dans la population ne peuvent pas faire.

Puis naturellement, la prochaine opération est de figurer à l'extérieur une voie d'écailler cette technologie tels que ce peut devenir une technique diagnostique, de sorte qu'il puisse être employé dans la clinique ainsi qu'un outil de recherches.

Que pensez-vous les futures prises pour le dépistage unique de molécule et l'analyse unicellulaire ?

Je pense que chacun des deux endroits sont incroyablement prometteurs. La chose qui unit choisissent le dépistage de molécule et l'analyse unicellulaire est que la molécule est l'élément principal de la chimie et la cellule est l'élément principal de la biologie.

Nous sommes pendant les débuts mêmes de pouvoir analyser les molécules uniques, regarder des populations des molécules, et avec une partie des technologies plus biophysiques, du regard les molécules uniques et les observer au fil du temps. Mon laboratoire a expliqué cette capacité avec les molécules uniques relativement grandes telles que des enzymes.

Les cellules sont les éléments principaux de la biologie. Juste comme les cellules ont des différences quand vous commencez à regarder les niveaux des protéines dans elles ou la séquence de l'ADN en cellules en apparence identiques, quand vous regardez les molécules uniques, vous voyez également une distribution des comportements.

Nous sommes maintenant à l'étape où nous avons les technologies et la définition de commencer à observer ces genres de différences individuelles entre les comportements de différentes molécules et différentes cellules. Je pense qu'elle va récrire certainement certains des manuels dans les domaines tels que des biochimies et la biologie parce qu'il n'y a aucune une telle chose comme une molécule moyenne ou une cellule moyenne. Chaque cellule a sa propre identité. Chaque molécule a sa propre identité.

Ces comportements ont été précédemment traités en tant que propriétés moyennes des molécules et des cellules. Le comportement stochastique de différentes molécules peut avoir des implications significatives qui affectent des procédés biochimiques, des voies et éventuel les propriétés de différentes cellules. Et vous pouvez commencer à regarder ces voies et procédés et conjecture comment les propriétés de différentes molécules se manifestent au niveau unicellulaire.

Quelles avances en technologie aimez-vous voir et pourquoi ?

Une chose que je voudrais continuer dans mon laboratoire doit pousser la limite de sensibilité pour trouver encore des concentrations inférieures que nous avons pu réaliser jusqu'ici. Ce que nous avons pu accomplir jusqu'ici est de mesurer des protéines à deux à trois ordres de grandeur abaissent la concentration. Il serait grand de chercher encore dix à cent fois plus de sensibilité.

Il y a beaucoup plus de des choses que nous pourrons regarder avec un de plus haut niveau de la sensibilité. Même aujourd'hui, quand nous mesurons des prises de sang, nous ne voyons pas certaines protéines parce que la technologie d'analyse de Simoa, même avec sa sensibilité plus élevée de mille-pli, ne nous donne pas la sensibilité dont nous avons besoin pour mesurer certaines des molécules actuelles dans le sang à des niveaux d'expression plus bas. Je voudrais voir le mouvement prolongé de cette limite de dépistage inférieure aux niveaux bien plus sensibles.

Je pense également qu'il serait grand de pouvoir augmenter le niveau du multiplexage de sorte que plus de molécules de différents types puissent être mesurées simultanément.

Puis en conclusion, et c'est quelque chose que je n'ai pas une solution technique pour mais certainement quelque chose que je voudrais voir, je voudrais pouvoir commencer à s'appliquer ce genre de technologie de compte moléculaire aux petites molécules. Nous employons les immunoessais et les analyses d'acide nucléique qui captent de grandes molécules, mais la technologie que nous avons développée n'est réellement pas favorable à pouvoir mesurer des petites molécules telles que des métabolites. Évidemment il serait grand de pouvoir faire cela.

Où peuvent les lecteurs trouver plus d'informations ?

L'inducteur change tellement rapidement que la meilleure chose à faire est simplement recherche de « Simoa », et il y aura cents articles où la technologie utilisé pour différentes applications.

Au sujet de professeur David Walt

WALT DE DAVID

David R. Walt est le professeur d'Université, le professeur de la chimie, le professeur de la génétique, le professeur du génie biomédical à l'université de touffes et est un professeur de Howard Hughes Medical Institute. Il a reçu un B.S. en chimie de l'Université du Michigan et un Ph.D. dans la biologie chimique de SUNY au ruisseau pierreux.

Son laboratoire a frayé un chemin le développement des choix de microwell, qui ont eu comme conséquence la découverte des choix de talon qui ont révolutionné l'inducteur de l'analyse génétique. Le laboratoire de M. Walt's a également introduit l'idée du dépistage digital de protéine en développant une technologie élevée de débit pour exécuter l'analyse unique de molécule.

Des efforts actuels dans le laboratoire sont visés mesurant la variation de la protéine et de l'expression du gène dans les cellules, des études principales des populations des molécules uniques d'enzymes et des nanoparticles uniques, ainsi que le dépistage ultra-sensible des biomarqueurs pour le cancer, la maladie infectieuse, et les agents biologiques de danger.

M. Walt est le fondateur scientifique et un ancien directeur d'Illumina Inc. et le fondateur scientifique et un directeur de Quanterix Corp. qu'il est un directeur de Cerulean Pharma Inc. et Exicure, Inc. ainsi que fondateur et directeur d'Ultivue, Inc. et des biotechnologies d'arbre.

Il a précédemment servi de co-président du conseil d'académie nationale des sciences sur les sciences et technologies chimiques. M. Walt a publié plus de 300 papiers pair-observés et l'a plus de 75 brevets publiés des USA.

Il a reçu les nombreux les récompenses et honneurs nationaux et d'international pour son travail principal et appliqué dans le domaine des choix optiques et des molécules uniques comprenant la société chimique américaine (ACS) Kathryn C. Hach Award pour la réussite entreprenante (2017), Ralph N. Adams Award en chimie de Bioanalytical (2016), récompense de Gustavus John Esselen (2014), récompense d'analyse de Spectrochemical de chimie analytique (2013), la récompense de chimie analytique de Pittsburgh (2013), et la récompense nationale d'ACS pour l'invention créative (2010).

Il est un membre du conservatoire national du bureau d'études et du conservatoire national du médicament, d'un camarade de l'Académie américaine des arts et des sciences, d'un camarade de l'institut américain pour le bureau d'études médical et biologique, et d'un camarade du conservatoire national des inventeurs.

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