Singola rilevazione della molecola delle proteine in unicellulari

Un'intervista con il professor David Walt, Tufts University, ha condotto da ora ad aprile Cashin-Garbutt, il mA (Cantab)

Potete fare prego un'introduzione alla singola schiera della molecola (Simoa) che vi siete sviluppato e quello discuterete nella vostra conversazione a Pittcon 2017?

Abbiamo sviluppato questa tecnologia quasi 10 anni fa. È stata sviluppata dopo che un esperimento chiave è stato effettuato da David Rissin, che era allora un candidato di PhD nel mio laboratorio.

Quando, stavamo lavorando con le schiere del microwell per un progetto differente. Ad una riunione del laboratorio ho posto la domanda: “Quante molecole di una molecola fluorescente avrebbe catturato per portare la concentrazione in uno di questi microwells molto minuscoli ad un livello che sarebbe stato facilmente rilevabile?„ Abbiamo eseguito il calcolo ed è risultato essere circa 100 molecole di una tintura fluorescente.

David ha effettuato un esperimento facendo uso di una schiera a fibra ottica del microwell, che ha avuta circa 60.000 microwells sull'estremità di una fibra ottica. Abbiamo intrappolato una soluzione diluita molto di un enzima in questi microwells-ogni microwell abbiamo avuti un volume dell'ordine di 40 femtoliters (10-15 litri) - un volume molto minuscolo.

Pittcon Simoa

L'esperimento è stato destinato per intrappolare una soluzione diluita molto di un enzima che contiene un'alta concentrazione di substrato. I substrati sono i prodotti base per gli enzimi, tali che se ci fosse un presente degli enzimi, l'enzima avrebbe catalizzato la conversione di quel substrato in molte molecole di un prodotto fluorescente. Questo trattamento si presenterebbe abbastanza rapido con β-galattosidasi, che è un enzima equo attivo.

L'idea era che avremmo eseguito questa reazione a così concentrazione diluita di enzima che soltanto una frazione dei pozzi avrebbe contenuto una molecola degli enzimi e soltanto quei pozzi che hanno fatto avrebbero stato flourescenti. Dopo David che Rissin ha risolto i dettagli tecnici tenuti ad effettuare l'esperimento, lui ha dimostrato che uno potrebbe vedere chiaramente quali pozzi hanno contenuto una molecola degli enzimi perché hanno girato il rosso molto luminoso contrariamente ai pozzi che non hanno contenuto molecola degli enzimi, che rimanesse nera.

Dopo questa dimostrazione, abbiamo osservato che mentre abbiamo fatto diminuire la concentrazione negli enzimi, abbiamo osservato meno pozzi fluorescenti perché c'erano meno molecole degli enzimi nella schiera. Abbiamo pubblicato un documento nelle lettere nane ed abbiamo sostenuto che questo era la prima volta che chiunque aveva misurato la concentrazione contando le molecole.

Così questo esperimento era la prima dimostrazione che potreste catturare una soluzione, la limita nei volumi molto minuscoli e letteralmente conta il numero delle molecole presenti in quella soluzione. In questo caso, la concentrazione nella β-galattosidasi ha potuto essere misurata semplicemente contando il numero dei pozzi luminosi riguardante il numero dei pozzi scuri.

Singole schiere molecolari

Simoa è stato sviluppato perché ci siamo domandati se potessimo usare questo approccio realmente alle cose della misura cui la gente si è preoccupata per. Per esempio, i biologi sono particolarmente interessati in molecole di misurazione quali gli acidi nucleici e le proteine.

Col passare del tempo, la singola tecnologia di schiera della molecola sviluppata dove i reagenti obbligatori ora sono fissati alle microsfere o alle perle del `' per catturare le molecole dell'obiettivo di interesse dalla soluzione. Le perle che contengono le molecole rilegate dell'obiettivo poi sono contrassegnate con una molecola degli enzimi e caricato nei pozzi e nei pozzi sono sigillati.

Se c'è una molecola degli enzimi fissata ad una perla, funge da reporter per la molecola dell'acido nucleico o la molecola di proteina di interesse. La molecola fissata degli enzimi catalizza la conversione di molte molecole del substrato nel prodotto tali che i pozzi che contengono l'enzima svilupperanno localmente un'alta concentrazione di prodotto e saranno flourescenti. I pozzi che non contengono le perle ma molecole rilegate resteranno scuri. Quella è l'intera evoluzione della tecnologia.

Quanto sensibile è Simoa ad individuare le proteine e gli acidi nucleici?

Riguardo agli acidi nucleici, è vicino ad altre tecniche sensibili quale la reazione a catena della polimerasi (PCR). Per esempio, ci sono stati dimostrazioni dove una sequenza particolare dell'acido nucleico può essere individuata a femtomolar (10)-15 la concentrazione in modo dalla sensibilità può anche essere superiori a quella.

Lo stesso va per le proteine in cui il limite di Simoa di rilevazione è tipicamente circa un fattore 100 - 1000 volte di più sensibile del metodo tradizionale di esecuzione della tecnica di analisi dell'immunosorbente enzima-collegata analisi- della proteina (ELISA). La tecnologia di Simoa apre il potenziale per potere misurare le proteine alle concentrazioni che non sono state individuate mai prima in vari generi di campioni compreso sangue, che è il fuoco principale per alle le analisi basate Simoa.

Potete spiegare prego come avete applicato il metodo all'analisi delle cellule tumorali coltivate?

Abbiamo cambiato semplicemente la manipolazione ed il preparato del campione in moda da poterlo applicarsi ad un'analisi unicellulare. È ancora un'analisi convenzionale di Simoa che usa gli anticorpi di bloccaggio fissati alle perle per legare le proteine di interesse in diverse celle.

Per il preparato del campione, in primo luogo isoliamo le diverse celle, manualmente o con varie procedure unicellulari di isolamento quali citometria a flusso o il microfluidics. Il tasto è di isolare le diverse celle nei volumi molto piccoli.

Poi catturiamo le celle isolate e le facciamo l'elettrolisi per interrompere le loro membrane e per scaricare i loro contenuti in un piccolo volume di buffer. Poi aggiungiamo le perle e catturiamo le molecole che siamo interessati nella rilevazione. Tutto poi segue il flusso di lavoro convenzionale per Simoa.

Lo scopo è di potere studiare le diverse celle all'interno di una popolazione. Ora è riconosciuto che omogeneizzando una popolazione delle celle, tipicamente milioni di migliaia se non di celle quando effettuare una misura dà una concentrazione media della proteina o dell'acido nucleico che è nelle celle. Tali misure mascherano l'eterogeneità della popolazione delle cellule.

Facendo uso di Simoa possiamo misurare le concentrazioni nella proteina in diverse cellule tumorali. L'osservazione dei centinaia di celle per volta al livello unicellulare fornisce la comprensione nell'eterogeneità della popolazione delle cellule. Sviluppando una tecnologia che può misurare le concentrazioni nella proteina in diverse celle, possiamo esaminare la distribuzione delle concentrazioni nella proteina all'interno della popolazione.

Un uso possibile una tal tecnologia sarebbe in una regolazione clinica per studiare le biopsie del tessuto. Per esempio, se uno catturasse una biopsia del ago di stampa da una donna che ha avuta un mammogramma anormale, le diverse celle potrebbero poi essere dissociate da quel tessuto di biopsia ed essere analizzate, rispetto ad esaminare la media della popolazione.

Questo approccio è importante perché se ci fossero delle celle rare nel campione che è sembrato avere un fenotipo particolarmente aggressivo, anche uno su 1.000 o su uno su 10.000 celle in quel campione di tessuto, sarebbe difficile da individuare quella cella se doveste omogeneizzare il tessuto in primo luogo e steste osservando soltanto la media della popolazione delle cellule. Questa cella aggressiva particolarmente rara sta andando dividersi rapido e potrebbe finire il piombo alla malattia metastatica ed infine ad un risultato difficile per il paziente.

Quando i patologi valutano i campioni di biopsia, esaminano la popolazione globale delle cellule e non ottengono il livello di granularità che è necessaria da determinare se c'è un presente raro particolarmente aggressivo delle cellule che darà al paziente una cattiva prognosi. Esaminando la media, potreste concludere bene, “, 9.999 celle sono normali„ perché quella 10,000th cella rara è fatta la media nei risultati ed i risultati quindi sono influenzati a favore della media della popolazione.

Che cosa altre applicazioni di Simoa sono là?

C'è un'ampia varietà di indicazioni cliniche che sono studiate. Questa tecnologia ora è stata commercializzata dalla società di Quanterix-a basata su Massachusetts di cui sono il fondatore scientifico. Hanno conceduto una licenza ai brevetti che hanno uscito dal mio laboratorio dei ciuffi e stanno commercializzando la tecnologia.

Il mio laboratorio è stato messo a fuoco soprattutto su rilevazione della malattia infettiva e del cancro al seno. Ora stiamo cominciando ad esaminare la malattia del Parkinson facendo uso della tecnologia. Altri ricercatori stanno esaminando le varie malattie infiammatorie. C'è egualmente una comunità equo sostanziale che sta usando la tecnologia per esaminare i disordini neurologici; in particolare, le cose gradiscono il trauma cranico traumatico.

La lega nazionale di football americano negli Stati Uniti ha costituito un fondo per alcuna della ricerca che sta esaminando gli indicatori rilasciati dal cervello quando il cervello avverte una lesione traumatica. Queste proteine sono rilasciate e sembrano nella circolazione sanguigna e sembrano essere altamente premonirici delle dimensioni del trauma del cervello.

Altri ricercatori hanno usato la tecnologia di Simoa per cominciare ad esaminare gli indicatori di sangue per il morbo di Alzheimer. Ancora altri stanno usando Simoa per individuare i segni in anticipo degli attacchi di cuore, misurando determinate proteine che sono rilasciate nelle fasi iniziali quando il cuore sta cominciando ad avere emissioni.

Che cosa i membri del pubblico impareranno dalla vostra conversazione a Pittcon 2017?

A Pittcon parlerò di alcuni dei dettagli tecnici del preparato del campione per ottenere gli unicellulari isolati per effettuare le misure biologiche significative.

Egualmente presenterò alcuno del nostro ultimo lavoro con le varie cellule tumorali coltivate in cui abbiamo potuti multiplexare le analisi e mostrerò alcune misure significative che indicano che abbiamo una buona probabilità di rilevazione delle celle rare quando applichiamo questa tecnologia ai campioni clinici.

Che Pittcon può fare per voi da AZoNetwork su Vimeo.

Che impatto pensate Simoa avete in futuro per quanto riguarda la rilevazione delle celle rare?

Già ho citato la rilevazione delle celle rare aggressive nelle biopsie del tessuto in una regolazione clinica ma c'è egualmente una componente della ricerca oltre alla componente clinica.

In una regolazione della ricerca, una delle domande interessanti dalla nostra prospettiva è a cui faccia queste celle rare assomigliano? Come differiscono dalla media della popolazione? C'è stato molto sforzo nella genomica unicellulare come conseguenza dell'ampia varietà di tecnologie genetiche, compreso ordinare, che ora sono disponibili. Come conseguenza di queste tecnologie, c'è la capacità per isolare le diverse celle, le etichetta e poi esamina come la genetica differisce dalla cella alla cella.

Naturalmente, quello sta dandoci una certa comprensione interessante nella variabilità della cella--cella ma una delle cose che la gente è estremamente interessata dentro è come faccia questi cambiamenti genetici manifesti in termini di come la cella esprime le proteine differenti e come la cella realmente differisce dalle sue celle circostanti?

Di nuovo, ottenere dal genotipo al fenotipo è un'area molto di meno esplorata ed è che cosa il mio laboratorio è su prova messa a fuoco di capire quanto grandi sono queste differenze fra le celle. Se possiamo ora combinare entrambe le tecnologie e correlare il genotipo- genetico differenza-con le proteine di modo di fenotipo- sono espressi e l'aspetto fisico della cella-poi stiamo andando avere molto meglio una comprensione di come le celle rare hanno la capacità di fare le cose che la maggior parte delle altre celle nella popolazione non possono fare.

Poi naturalmente, il punto seguente è di capire un modo sottoporre a operazioni di disgaggio su questa tecnologia tali che possa trasformarsi in in una tecnica diagnostica, di modo che può essere utilizzato nella clinica come pure in uno strumento della ricerca.

Che cosa pensate le tenute future per singola rilevazione della molecola e l'analisi unicellulare?

Penso che entrambe aree incredibilmente stiano promettendo. La cosa che si unisce sia sceglie la rilevazione della molecola che l'analisi unicellulare è che la molecola è l'unità fondamentale di chimica e la cella è l'unità fondamentale di biologia.

Siamo negli inizi stessi di potere analizzare le singole molecole, esaminare le popolazioni delle molecole e con alcuno delle tecnologie più biofisiche, dello sguardo le singole molecole ed osservarle col passare del tempo. Il mio laboratorio ha dimostrato questa capacità con le singole molecole relativamente grandi quali gli enzimi.

Gli unicellulari sono le unità fondamentali di biologia. Appena poichè gli unicellulari hanno differenze quando cominciate ad esaminare i livelli di proteine in loro o la sequenza di DNA in celle apparente identiche, quando esaminate le singole molecole, inoltre vedete una distribuzione dei comportamenti.

Ora siamo nella fase in cui abbiamo le tecnologie e la risoluzione cominciare ad osservare questi generi di diverse differenze fra i comportamenti di diverse molecole e le diverse celle. Penso che stia andando certamente riscrivere alcuni dei manuali nei campi quali la biochimica e la biologia perché c'è nessun qualcosa come una molecola media o una cella media. Ogni cella ha sua propria identità. Ogni molecola ha sua propria identità.

Questi comportamenti precedentemente sono stati trattati come i beni medii delle molecole e delle celle. Il comportamento stocastico di diverse molecole può avere implicazioni significative che pregiudicano i trattamenti biochimici, le vie ed infine i beni di diverse celle. E potete cominciare ad esaminare questi vie e trattamenti e congettura come i beni di diverse molecole si manifestano al livello unicellulare.

Che avanzamenti nella tecnologia gradite vedere e perché?

Una cosa che vorrei continuare nel mio laboratorio devo spingere il limite della sensibilità per individuare ancora le concentrazioni più basse che abbiamo potuti raggiungere finora. Che cosa abbiamo potuti compire finora è di misurare le proteine a due - tre ordini di grandezza abbassa la concentrazione. Sarebbe grande da cercare un altro cento-popolare dieci la più sensibilità.

Ci sono molto più di cose che potremo esaminare con un di più alto livello della sensibilità. Neppure oggi, quando stiamo misurando i campioni di sangue, non vediamo determinate proteine perché la tecnologia di analisi di Simoa, neppure con la sua più alta sensibilità del mille-popolare, ci non dà la sensibilità di che abbiamo bisogno per misurare alcune delle molecole presenti nel sangue ai più bassi livelli di espressione. Vorrei vedere il movimento continuato di quel limite di rilevazione più basso ai livelli ancor più sensibili.

Egualmente penso che sia stato grande da potere da aumentare il livello di multiplazione in moda da potere misurare simultaneamente più molecole dei tipi differenti.

Poi per concludere e questo è qualcosa che non ho una soluzione della tecnologia per ma certamente qualcosa che abbia voluto vedere, io vorrebbe potere cominciare ad applicare questo genere di tecnologia di conteggio molecolare alle piccole molecole. Usiamo i immunoassays e le analisi dell'acido nucleico che stanno catturando le grandi molecole, ma la tecnologia che abbiamo sviluppato non è realmente favorevole a potere misurare le piccole molecole quali i metaboliti. Sarebbe ovviamente grande da potere da fare quello.

Dove possono i lettori trovare più informazioni?

Il campo sta cambiando così rapido che la migliore cosa da fare è semplicemente ricerca “di Simoa„ e ci saranno cento articoli in cui la tecnologia usato per varie applicazioni.

Circa il professor David Walt

WALT DI DAVID

David R. Walt è professore universitario, professore di chimica, professore della genetica, professore di assistenza tecnica biomedica alla Tufts University ed è un professore di Howard Hughes Medical Institute. Ha ricevuto un B.S. in chimica dall'università del Michigan e un Ph.D. nella biologia chimica da SUNY al ruscello pietroso.

Il suo laboratorio ha aperto la strada allo sviluppo delle schiere del microwell, che hanno provocato la scoperta delle schiere della perla che hanno rivoluzionato il campo dell'analisi genetica. Il laboratorio del Dott. Walt egualmente ha introdotto l'idea di rilevazione digitale della proteina sviluppando un'alta tecnologia di capacità di lavorazione per l'esecuzione dell'analisi singola della molecola.

Gli sforzi attuali in laboratorio sono puntati su che misurano la variazione di proteina e di espressione genica in unicellulari, gli studi fondamentali delle popolazioni di singole molecole degli enzimi e di singole nanoparticelle come pure la rilevazione ultrasensibile dei biomarcatori per cancro, la malattia infettiva e gli agenti biologici di minaccia.

Il Dott. Walt è il fondatore scientifico e un ex Direttore di Illumina Inc. ed il fondatore scientifico e un Direttore di Quanterix Corp. È un Direttore di Cerulean Pharma Inc. ed Exicure, Inc. come pure fondatore e Direttore di Ultivue, biotecnologie del supporto conico e di Inc.

Precedentemente ha servito da co-presidente del quadro di Accademia nazionale delle scienze sulle scienze e tecnologie chimiche. Il Dott. Walt ha pubblicato oltre 300 documenti pari-esaminati ed ha oltre 75 brevetti registrati degli Stati Uniti.

Ha ricevuto i numerosi premi e onori dell'internazionale e nazionali per il suo lavoro fondamentale ed applicato nel campo delle schiere ottiche e di singole molecole compreso la società di prodotto chimico americano (ACS) Kathryn C. Hach l'Award per successo imprenditoriale (2017), Ralph N. Adams l'Award in chimica di Bioanalytical (2016), premio di Gustavus John Esselen (2014), premio spettrochimico dell'analisi di chimica analitica (2013), il premio di chimica analitica di Pittsburgh (2013) ed il premio nazionale di ACS per l'invenzione creativa (2010).

È un membro dell'accademia di assistenza tecnica nazionale e dell'accademia nazionale di medicina, di un collega dell'accademia americana delle arti e delle scienze, di un collega dell'istituto americano per assistenza tecnica medica e biologica e di un collega dell'accademia nazionale degli inventori.

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