Única detecção da molécula de proteínas em únicas pilhas

Uma entrevista com professor David Walt, universidade dos topetes, conduziu daqui até abril Cashin-Garbutt, miliampère (Cantab)

Pode você por favor dá-lo a uma introdução à única disposição da molécula (Simoa) para ter-se tornado e isso que você estará discutindo em sua conversa em Pittcon 2017?

Nós desenvolvemos esta tecnologia quase 10 anos há. Foi desenvolvida depois que uma experiência chave foi realizada por David Rissin, que era um candidato do PhD em meu laboratório naquele tempo.

Então, nós estávamos trabalhando com disposições do microwell para um projecto diferente. Em uma reunião do laboratório eu levantei a pergunta: “Quantas moléculas de uma molécula fluorescente tomaria para trazer a concentração em um destes microwells muito minúsculos a um nível que fosse facilmente detectável?” Nós executamos o cálculo e despejou ser aproximadamente 100 moléculas de uma tintura fluorescente.

David realizou uma experiência usando uma disposição do microwell da fibra óptica, que tivesse aproximadamente 60.000 microwells na extremidade de uma fibra óptica. Nós prendemos uma solução muito diluída de uma enzima nos estes microwells-cada microwell tivemos um volume do pedido de 40 femtoliters (10-15 litros) - um volume muito minúsculo.

Pittcon Simoa

A experiência foi projectada prender uma solução muito diluída de uma enzima que contem uma concentração alta de uma carcaça. As carcaças são os materiais começar para enzimas, tais que se havia um presente da enzima, a enzima catalisaria a conversão dessa carcaça em muitas moléculas de um produto fluorescente. Este processo ocorreria bastante ràpida com β-galactosidase, que é uma enzima razoavelmente activa.

A ideia era que nós executaríamos esta reacção em uma concentração tão diluída de enzima que somente uma fracção dos poços contivesse uma molécula da enzima e somente aqueles poços que fizeram brilhassem. Após David que Rissin dou certo os detalhes técnicos exigidos realizar a experiência, ele demonstrou que uma poderia claramente ver que poços contiveram uma molécula da enzima porque giraram o vermelho muito brilhante em contraste com os poços que não contiveram nenhuma molécula da enzima, que permaneceu preta.

Após esta demonstração, nós observamos que como nós diminuímos a concentração da enzima, nós observamos menos poços fluorescentes porque havia menos moléculas da enzima na disposição. Nós publicamos um papel em letras Nano e reivindicamos que este era a primeira vez que qualquer um tinha medido a concentração contando moléculas.

Assim esta experiência era a primeira demonstração que você poderia tomar uma solução, limita-a em volumes muito minúsculos e conta-a literalmente o número de moléculas actuais nessa solução. Neste caso, a concentração da β-galactosidase podia ser medida simplesmente contando o número de poços brilhantes relativo ao número de poços escuros.

Únicas disposições moleculars

Simoa foi desenvolvido porque nós quisemos saber se nós poderíamos usar esta aproximação para medir realmente as coisas que os povos se importaram com. Por exemplo, os biólogos estão particularmente interessados em moléculas de medição tais como ácidos nucleicos e proteínas.

Ao longo do tempo, a única tecnologia da disposição da molécula desenvolvida onde os reagentes obrigatórios são anexados agora às microsfera ou aos grânulos do `' a fim capturar as moléculas do alvo do interesse da solução. Os grânulos que contêm as moléculas encadernadas do alvo são etiquetados então com uma molécula da enzima e carregado nos poços e nos poços são selados.

Se há uma molécula da enzima anexada a um grânulo, actua como um repórter para a molécula do ácido nucleico ou a molécula de proteína do interesse. A molécula anexada da enzima catalisa a conversão de muitas moléculas da carcaça no produto tais que os poços que contêm a enzima acumularão uma concentração localmente alta de produto e brilharão. Os poços que não contêm grânulos mas nenhuma molécula encadernada ficarão escuros. Aquela é a evolução inteira da tecnologia.

Como sensível é Simoa em detectar proteínas e ácidos nucleicos?

No que diz respeito aos ácidos nucleicos, é perto de outras técnicas sensíveis tais como a reacção em cadeia da polimerase (PCR). Por exemplo, houve as demonstrações onde uma seqüência particular do ácido nucleico pode ser detectada (em 10)-15 concentrações femtomolar assim que a sensibilidade pode mesmo ser mais alta do que aquela.

O mesmo vai para as proteínas onde o limite de Simoa de detecção é tipicamente sobre um factor 100 a 1000 vezes de mais sensível do que o método tradicional de executar uma técnica enzima-ligada ensaio- do ensaio da imunoabsorção da proteína (ELISA). A tecnologia de Simoa abre o potencial para poder medir proteínas nas concentrações que têm sido detectadas nunca antes em vários tipos das amostras que incluem o sangue, que é o foco principal para ensaios Simoa-baseados.

Pode você por favor explicar como você aplicou o método à análise de células cancerosas cultivadas?

Nós mudamos simplesmente a manipulação e a preparação da amostra de modo que pudesse ser aplicada a um único ensaio da pilha. É ainda um ensaio convencional de Simoa que use os anticorpos da captação anexados aos grânulos a fim ligar proteínas do interesse em pilhas individuais.

Para a preparação da amostra, nós isolamos primeiramente pilhas individuais, manualmente ou com uma variedade de únicos procedimentos do isolamento da pilha tais como o cytometry de fluxo ou o microfluidics. A chave é isolar pilhas individuais em volumes muito pequenos.

Nós então tomamos as pilhas isoladas e lyse as para interromper suas membranas e para liberar seus índices em um volume pequeno de amortecedor. Nós então adicionamos grânulos e capturamos as moléculas que nós estamos interessados na detecção. Tudo segue então os trabalhos convencionais para Simoa.

O objetivo é poder estudar pilhas individuais dentro de uma população. Reconhece-se agora que homogeneizando uma população das pilhas, tipicamente milhões dos milhares se não de pilhas, quando fazer uma medida dá uma concentração média da proteína ou do ácido nucleico que está nas pilhas. Tais medidas mascaram a heterogeneidade da população da pilha.

Usando Simoa nós podemos medir as concentrações da proteína em células cancerosas individuais. Observar centenas de pilhas em um momento a único nível da pilha fornece a introspecção na heterogeneidade da população da pilha. Desenvolvendo uma tecnologia que possa medir as concentrações da proteína em pilhas individuais, nós podemos olhar a distribuição de concentrações da proteína dentro da população.

Um uso possível tal tecnologia estaria em um ajuste clínico para estudar biópsias do tecido. Por exemplo, se um tomou uma biópsia da agulha de uma mulher que tivesse um mamograma anormal, as pilhas individuais poderiam então ser separadas desse tecido da biópsia e ser analisadas, ao contrário de olhar a média da população.

Esta aproximação é importante porque se havia alguma pilha rara na amostra que aconteceu ter um fenótipo particularmente agressivo, mesmo um de 1.000 ou de um de 10.000 pilhas nessa amostra de tecido, seria difícil detectar essa pilha se você devia homogeneizar primeiramente o tecido e estava olhando somente na média da população da pilha. Esta pilha agressiva particularmente rara está indo dividir-se ràpida e poderia terminar acima a condução à doença metastática e finalmente a um resultado deficiente para o paciente.

Quando os patologistas avaliam amostras da biópsia, olham a população total da pilha e não obtêm o nível de granulosidade que é necessária para determinar se há um presente raro particularmente agressivo da pilha que dê ao paciente um prognóstico ruim. Olhando a média, você pôde concluir, “bem, 9.999 pilhas são normais” porque essa 10,000th pilha rara é calculada a média nos resultados e os resultados são inclinados conseqüentemente em favor da média da população.

Que outras aplicações de Simoa são lá?

Há uma grande variedade de indicações clínicas que estão sendo investigadas. Esta tecnologia tem sido comercializada agora pela empresa de Quanterix-a baseada em Massachusetts de que eu sou o fundador científico. Licenciaram as patentes que saíram de meu laboratório dos topetes e estão comercializando a tecnologia.

Meu laboratório foi centrado primeiramente sobre a detecção do cancro da mama e da doença infecciosa. Nós estamos começando agora a olhar a doença de Parkinson usando a tecnologia. Outros pesquisadores estão olhando várias doenças inflamatórios. Há igualmente uma comunidade razoavelmente substancial que esteja usando a tecnologia para olhar desordens neurológicas; em particular, as coisas gostam da lesão cerebral traumático.

A Liga Nacional de Futebol Americano nos E.U. financiou alguma da pesquisa que está olhando os marcadores liberados do cérebro quando o cérebro experimenta um ferimento traumático. Estas proteínas são liberadas e parecem na circulação sanguínea, e parecem ser altamente com carácter de previsão da extensão do traumatismo do cérebro.

Outros pesquisadores usaram a tecnologia de Simoa para começar a olhar marcadores do sangue para a doença de Alzheimer. Ainda outro estão usando Simoa para detectar sinais adiantados de cardíaco de ataque, medindo determinadas proteínas que são liberadas nas fases iniciais quando o coração está começando a ter edições.

Que os membros da audiência aprenderão de sua conversa em Pittcon 2017?

Em Pittcon eu estarei falando sobre alguns dos detalhes técnicos de preparação da amostra para obter únicas pilhas isoladas para fazer medidas biológicas significativas.

Eu igualmente apresentarei algum de nosso trabalho mais atrasado com várias células cancerosas cultivadas onde nós pudemos multiplexar os ensaios e eu mostrarei algumas medidas significativas que indicam que nós temos uma boa possibilidade de detectar pilhas raras quando nós aplicamos esta tecnologia às amostras clínicas.

Que Pittcon pode fazer para você de AZoNetwork em Vimeo.

Que impacto você pensa Simoa tem no futuro a propósito de detectar pilhas raras?

Eu tenho mencionado já a detecção de pilhas raras agressivas em biópsias do tecido em um ajuste clínico mas há igualmente um componente da pesquisa além do que o componente clínico.

Em um ajuste da pesquisa, uma das perguntas interessantes de nossa perspectiva é o que faça estas pilhas raras olham como? Como diferem da média da população? É havido muito esforço na única genómica da pilha em conseqüência da grande variedade de tecnologias genéticas, incluindo arranjar em seqüência, que estão agora disponíveis. Em conseqüência destas tecnologias, há a capacidade para isolar pilhas individuais, etiqueta-as e olha-as então como a genética difere da pilha à pilha.

Naturalmente, isso está dando-nos alguma introspecção interessante na variabilidade da pilha-à-pilha mas uma das coisas que os povos estão extremamente interessados dentro é como faça estas mudanças genéticas manifestas em termos de como a pilha expressa proteínas diferentes e de como a pilha difere realmente de suas pilhas circunvizinhas?

Além disso, obter do genótipo ao fenótipo é uma área muito menos explorada, e é qual meu laboratório é em-tentativa focalizada compreender como grandes são estas diferenças entre pilhas. Se nós podemos agora combinar ambas as tecnologias e para correlacionar o genótipo- genético diferença-com as proteínas da maneira do fenótipo- estão expressados e a aparência física da pilha-então nós estamos indo ter muito melhor uma compreensão de como as pilhas raras têm a capacidade para fazer as coisas que a maioria das outras pilhas na população não podem fazer.

Então naturalmente, o passo seguinte é figurar para fora uma maneira de escalar acima esta tecnologia tais que pode se transformar uma técnica diagnóstica, de modo que possa ser usado na clínica assim como em uma ferramenta da pesquisa.

Que você pensa as posses futuras para a única detecção da molécula e a única análise da pilha?

Eu penso que both of these áreas são incredibly prometedoras. A coisa que se une escolhe a detecção da molécula e a única análise da pilha é que a molécula é a unidade fundamental de química e a pilha é a unidade fundamental de biologia.

Nós estamos no princípio mesmo de poder analisar únicas moléculas, olhar populações das moléculas, e com algum das tecnologias mais biofísicas, do olhar em únicas moléculas e observá-las ao longo do tempo. Meu laboratório demonstrou esta capacidade com as únicas moléculas relativamente grandes tais como enzimas.

As únicas pilhas são as unidades fundamentais de biologia. Apenas porque as únicas pilhas têm diferenças quando você começa a olhar os níveis de proteínas nelas ou a seqüência do ADN em pilhas ostensibly idênticas, quando você olha únicas moléculas, você igualmente vê uma distribuição dos comportamentos.

Nós somos agora na fase onde nós temos as tecnologias e a definição começar a observar estes tipos de diferenças individuais entre os comportamentos de moléculas individuais e pilhas individuais. Eu penso que está indo reescrever certamente alguns dos livros de texto nos campos tais como a bioquímica e a biologia porque não há nenhuma coisa como uma molécula média ou uma pilha média. Cada pilha tem sua própria identidade. Cada molécula tem sua própria identidade.

Estes comportamentos têm sido tratados previamente como as propriedades médias das moléculas e das pilhas. O comportamento estocástico de moléculas individuais pode ter as implicações significativas que afectam processos bioquímicos, caminhos e finalmente as propriedades de pilhas individuais. E você pode começar a olhar estes caminhos e processos e conjectura como as propriedades de moléculas individuais se manifestam a único nível da pilha.

Que avanços na tecnologia você gosta de ver e porque?

Uma coisa de que eu gostaria de continuar em meu laboratório devo empurrar o limite da sensibilidade para detectar mesmo umas mais baixas concentrações do que nós pudemos conseguir até agora. O que nós pudemos realizar até agora é medir proteínas em dois a três ordens de grandeza abaixa a concentração. Seria grande procurar uns outros dez a de cem vezes mais sensibilidade.

Há muito mais umas coisas que nós poderemos olhar com um de mais alto nível da sensibilidade. Mesmo hoje, quando nós estamos medindo amostras de sangue, nós não vemos determinadas proteínas porque a tecnologia do ensaio de Simoa, mesmo com sua sensibilidade mais alta da mil-dobra, não nos dá a sensibilidade que nós precisamos de medir algumas das moléculas actuais no sangue a mais baixos níveis da expressão. Eu gostaria de ver o movimento continuado desse mais baixo limite de detecção aos níveis ainda mais sensíveis.

Eu igualmente penso que seria grande poder aumentar o nível de multiplexação de modo que mais moléculas de tipos diferentes possam ser medidas simultaneamente.

Então finalmente, e este é algo que eu não tenho uma solução da tecnologia para mas certamente algo que eu gostaria de ver, mim gostaria de poder começar a aplicar este tipo da tecnologia de contagem molecular às moléculas pequenas. Nós usamos os immunoassays e os ensaios do ácido nucleico que estão capturando grandes moléculas, mas a tecnologia que nós desenvolvemos não é realmente favorável a poder medir moléculas pequenas tais como metabolitos. Obviamente seria grande poder fazer isso.

Onde podem os leitores encontrar mais informação?

O campo está mudando tão ràpida que a melhor coisa a fazer é simplesmente busca para “Simoa”, e haverá cem artigos onde a tecnologia usado para várias aplicações.

Sobre o professor David Walt

WALT DE DAVID

David R. Walt é o catedrático, professor da química, professor da genética, professor da engenharia biomedicável na universidade dos topetes e é um professor do Howard Hughes Medical Institute. Recebeu um B.S. na química da Universidade do Michigan e um Ph.D. na biologia química de SUNY no ribeiro rochoso.

Seu laboratório abriu caminho a revelação das disposições do microwell, que conduziram à descoberta das disposições do grânulo que revolucionaram o campo da análise genética. O laboratório do Dr. Walt igualmente introduziu a ideia da detecção digital da proteína desenvolvendo uma tecnologia alta da produção para executar a única análise da molécula.

Os esforços actuais no laboratório são visados que medem a variação da proteína e da expressão genética em únicas pilhas, estudos fundamentais das populações de únicas moléculas da enzima e de únicos nanoparticles, assim como a detecção ultrasensitive de biomarkers para o cancro, a doença infecciosa, e agentes biológicos da ameaça.

O Dr. Walt é o fundador científico e um director anterior de Illumina Inc. e fundador científico e um director de Quanterix Corp. É um director de Cerulean Pharma Inc. e Exicure, Inc. assim como fundador e director de Ultivue, biotecnologias de Inc. e de mandril.

Serviu previamente como o organizador da placa de Academia Nacional das Ciências em ciências e na tecnologia químicas. O Dr. Walt publicou sobre 300 papéis par-revistos e tem sobre 75 patentes emitidas dos E.U.

Recebeu concessões e honras numerosas nacionais e do international para seu trabalho fundamental e aplicado no campo de disposições ópticas e únicas das moléculas que incluem a sociedade de produto químico americano (ACS) Kathryn C. Hach Concessão para o sucesso empreendedor (2017), Ralph N. Adams Concessão na química de Bioanalytical (2016), concessão de Gustavus John Esselen (2014), concessão da análise de Spectrochemical da química analítica (2013), a concessão da química analítica de Pittsburgh (2013), e a concessão nacional de ACS para a invenção criativa (2010).

É um membro da academia de engenharia nacional e da academia nacional da medicina, de um companheiro da academia americana das artes e das ciências, de um companheiro do instituto americano para a engenharia médica e biológica, e de um companheiro da academia nacional dos inventores.

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