Única detección de la molécula de proteínas en células

Una entrevista con profesor David Walt, universidad de los penachos, conducto en abril Cashin-Garbutt, mA (Cantab)

¿Puede usted por favor darle a una introducción al único arsenal de la molécula (Simoa) haberse convertido y eso que usted discutirá en su charla en Pittcon 2017?

Desarrollamos esta tecnología hace casi 10 años. Fue desarrollada después de que un experimento dominante fuera realizado por David Rissin, que era un candidato del doctorado en mi laboratorio en ese entonces.

Cuando, trabajábamos con las matrices del microwell para un diverso proyecto. En una reunión del laboratorio planteé la pregunta: “Cuántas moléculas de una molécula fluorescente tomaría para traer la concentración en uno de estos microwells muy minúsculos a un nivel que sería fácilmente perceptible?” Realizamos el cálculo y resultó ser cerca de 100 moléculas de un tinte fluorescente.

David realizó un experimento usando un arsenal del microwell de la fibra óptica, que tenía aproximadamente 60.000 microwells en el extremo de una fibra óptica. Atrapamos una solución muy diluida de una enzima en estos microwells-cada microwell teníamos un volumen de la orden de 40 femtoliters (10-15 litros) - un volumen muy minúsculo.

Pittcon Simoa

El experimento fue diseñado para atrapar una solución muy diluida de una enzima que contenía una alta concentración de un substrato. Los substratos son las materias primas para las enzimas, tales que si hubiera un presente de la enzima, la enzima catalizaría la conversión de ese substrato en muchas moléculas de un producto fluorescente. Este proceso ocurriría muy rápidamente con la β-galactosidasa, que es una enzima bastante activa.

La idea era que ejecutaríamos esta reacción en una concentración tan diluída de enzima que solamente una parte de los pozos contendrían una molécula de la enzima y solamente esos pozos que lo hicieron serían fluorescentes. Después de David que Rissin resolvió a los detalles técnicos requeridos realizar el experimento, él demostró que uno podría ver sin obstrucción qué pozos contuvieron una molécula de la enzima porque giraron rojo muy brillante en contraste con los pozos que no contuvieron ninguna molécula de la enzima, que seguía siendo negra.

Después de esta demostración, observamos que como disminuimos la concentración de la enzima, observamos menos pozos fluorescentes porque había menos moléculas de la enzima en el arsenal. Publicamos un papel en cartas nanas y demandamos que éste era la primera vez que cualquier persona había medido la concentración contando las moléculas.

Este experimento era tan la primera demostración que usted podría tomar una solución, la linda en volúmenes muy minúsculos y cuenta literalmente el número de moléculas presentes en esa solución. En este caso, la concentración de la β-galactosidasa podía ser medida simple contando el número de pozos brillantes en relación con el número de pozos oscuros.

Únicas matrices moleculares

Simoa fue desarrollado porque nos preguntábamos si podríamos utilizar esta aproximación para medir real las cosas sobre las cuales la gente cuidó. Por ejemplo, los biólogos están determinado interesados en moléculas de medición tales como ácidos nucléicos y proteínas.

En un cierto plazo, la única tecnología del arsenal de la molécula desarrollada donde los reactivos obligatorios ahora se sujetan a las microesferas o a las molduras del `' para capturar las moléculas del objetivo del interés de la solución. Las molduras que contienen las moléculas encuadernadas del objetivo entonces etiqueta con una molécula de la enzima y cargado en los pozos y los pozos se tapan.

Si hay una molécula de la enzima sujetada a una moldura, actúa como reportero para la molécula del ácido nucléico o la molécula de proteína del interés. La molécula sujetada de la enzima cataliza la conversión de muchas moléculas del substrato en producto tales que los pozos que contienen la enzima aumentarán una concentración localmente alta de producto y serán fluorescentes. Los pozos que contienen molduras pero ningunas moléculas encuadernadas tirante oscuros. Ésa es la evolución entera de la tecnología.

¿Cómo sensible es Simoa en descubrir las proteínas y los ácidos nucléicos?

En cuanto a los ácidos nucléicos, está cerca de otras técnicas sensibles tales como la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Por ejemplo, ha habido las demostraciones donde una serie determinada del ácido nucléico se puede descubrir en femtomolar (10)-15 la concentración así que la sensibilidad pueden incluso ser más altas que ésa.

Lo mismo va para las proteínas donde está el límite de Simoa de detección típicamente sobre un factor 100 a 1000 veces de más sensible que el método tradicional de realizar una técnica enzima-conectada análisis- del análisis del inmunosorbente de la proteína (ELISA). La tecnología de Simoa abre el potencial para poder medir las proteínas en las concentraciones que nunca se han descubierto antes en diversas clases de muestras incluyendo la sangre, que es el foco principal para los análisis Simoa-basados.

¿Puede usted explicar por favor cómo usted ha aplicado el método al análisis de células cancerosas cultivadas?

Hemos cambiado simple el manejo y la preparación de la muestra para poderla aplicarse a un análisis unicelular. Sigue siendo un análisis convencional de Simoa que utiliza los anticuerpos de la captura sujetados a las molduras para atar las proteínas del interés en células individuales.

Para la preparación de la muestra, primero aislamos las células individuales, manualmente o con una variedad de procedimientos unicelulares del aislamiento tales como cytometry de flujo o microfluidics. La llave es aislar las células individuales en volúmenes muy pequeños.

Después tomamos las células aisladas y lyse las para romper sus membranas y para liberar sus contenidos en un pequeño volumen de almacenador intermedio. Después agregamos molduras y capturamos las moléculas que estamos interesados en descubrir. Todo entonces sigue el flujo de trabajo convencional para Simoa.

La meta es poder estudiar las células individuales dentro de una población. Ahora se reconoce que homogeneizando una población de células, típicamente millones de los millares si no de células, cuando la fabricación de una medición da una concentración media de la proteína o del ácido nucléico que está en las células. Tales mediciones encubren la heterogeneidad de la población de la célula.

Usando Simoa podemos medir las concentraciones de la proteína en células cancerosas individuales. La observación de centenares de células al mismo tiempo en el nivel unicelular ofrece discernimiento en la heterogeneidad de la población de la célula. Desarrollando una tecnología que pueda medir las concentraciones de la proteína en células individuales, podemos observar la distribución de las concentraciones de la proteína dentro de la población.

Un uso posible tal tecnología estaría en una fijación clínica para estudiar biopsias del tejido. Por ejemplo, si uno tomó una biopsia de la aguja de una mujer que tenía un mamograma anormal, las células individuales se podrían después disociar de ese tejido de la biopsia y analizar, en comparación con observar el promedio de la población.

Esta aproximación es importante porque si hubiera algunas células raras en la muestra que suceso tener un fenotipo determinado agresivo, incluso un de 1,000 o células de un de 10,000 en esa muestra de tejido, sería difícil descubrir esa célula si usted homogeneizara el tejido primero y consideraba solamente el promedio de la población de la célula. Esta célula agresiva determinado rara va a dividir rápidamente y podría terminar hacia arriba llevar a la enfermedad metastática y final a un resultado pobre para el paciente.

Cuando los patólogos evalúan muestras de la biopsia, observan la población total de la célula y no consiguen el nivel de granulosidad que sea necesaria determinar si hay un presente raro determinado agresivo de la célula que dará a paciente un pronóstico malo. Observando el promedio, usted puede ser que concluya, “bien, 9.999 células son normales” porque esa 10,000a célula rara se hace un promedio en los resultados y los resultados por lo tanto se orientan a favor del promedio de la población.

¿Cuáles otros usos de Simoa son allí?

Hay una amplia variedad de indicaciones clínicas que son investigadas. Esta tecnología ahora ha sido comercializada por la compañía de Quanterix-a basada en Massachusetts cuyo soy el fundador científico. Autorizaron las patentes que salieron de mi laboratorio de los penachos y están comercializando la tecnología.

Mi laboratorio se ha centrado sobre todo en cáncer de pecho y la detección de la enfermedad infecciosa. Ahora estamos comenzando a observar la enfermedad de Parkinson usando la tecnología. Otros investigadores están observando diversas enfermedades inflamatorias. Hay también una comunidad bastante sustancial que está utilizando la tecnología para observar desordenes neurológicos; particularmente, las cosas tienen gusto de la lesión cerebral traumática.

La Liga Nacional de Fútbol Americano en los E.E.U.U. ha financiado algo de la investigación que está observando los marcadores liberados del cerebro cuando el cerebro experimenta un daño traumático. Estas proteínas se liberan y aparecen en la circulación sanguínea, y aparecen ser altamente proféticas del fragmento del trauma del cerebro.

Otros investigadores han utilizado la tecnología de Simoa para comenzar a observar los marcadores de la sangre para la enfermedad de Alzheimer. Todavía otros están utilizando Simoa para descubrir signos tempranos de los ataques del corazón, midiendo ciertas proteínas que se liberen en los primeros tiempos cuando el corazón está comenzando a tener entregas.

¿Qué las piezas de la audiencia aprenderán de su charla en Pittcon 2017?

En Pittcon hablaré sobre algunos de los detalles técnicos de la preparación de la muestra para conseguir células aisladas para hacer mediciones biológicas significativas.

También presentaré algo de nuestro último trabajo con las diversas células cancerosas cultivadas donde hemos estado capaces de multiplexar los análisis y mostraré algunas mediciones significativas que indiquen que tenemos una buena ocasión de descubrir las células raras cuando aplicamos esta tecnología a las muestras clínicas.

Qué Pittcon puede hacer para usted de AZoNetwork en Vimeo.

¿Qué impacto usted piensa Simoa tiene en el futuro en lo que respecta a descubrir las células raras?

He mencionado ya la detección de células raras agresivas en biopsias del tejido en una fijación clínica pero hay también un componente de la investigación además del componente clínico.

¿En una fijación de la investigación, una de las preguntas interesantes desde nuestro punto de vista es lo que haga estas células raras parecen? ¿Cómo difieren del promedio de la población? Se hay mucho esfuerzo en la genómica unicelular como resultado de la gran variedad de tecnologías genéticas, incluyendo la secuencia, que están disponibles ahora. Como resultado de estas tecnologías, hay la capacidad para aislar las células individuales, las marca con etiqueta y después las observa cómo la genética difiere de la célula a la célula.

¿Por supuesto, eso nos está dando un cierto discernimiento interesante en variabilidad de la célula-a-célula pero una de las cosas que la gente está extremadamente interesada hacia adentro es cómo haga estos cambios genéticos evidentes en términos de cómo la célula expresa diversas proteínas y cómo la célula difiere real de sus células circundantes?

Una vez más el conseguir del genotipo al fenotipo es un área mucho menos explorada, y es cuál es el en-intentar mi laboratorio enfocado entender cómo son grandes son estas diferencias entre las células. Si podemos ahora combinar ambas tecnologías y correlacionar el genotipo- genético diferencia-con las proteínas de la manera del fenotipo- se expresan y el aspecto físico de la célula-entonces vamos a tener mucho mejor una comprensión de cómo las células raras tienen la capacidad de hacer las cosas que la mayor parte de las otras células en la población no pueden hacer.

Entonces por supuesto, el paso siguiente es imaginar una manera de aumentar proporcionalmente esta tecnología tales que puede convertirse en una técnica diagnóstica, para poderlo utilizar en la clínica así como una herramienta de la investigación.

¿Qué usted piensa los asimientos futuros para la única detección de la molécula y el análisis unicelular?

Pienso que ambas áreas son increíblemente prometedoras. La cosa que une escoge la detección de la molécula y el análisis unicelular es que la molécula es la unidad fundamental de la química y la célula es la unidad fundamental de la biología.

Estamos en los mismos comienzos de poder analizar las únicas moléculas, observar las poblaciones de moléculas, y con algo de las tecnologías más biofísicas, de la mirada las únicas moléculas y observarlas en un cierto plazo. Mi laboratorio ha demostrado esta capacidad con las únicas moléculas relativamente grandes tales como enzimas.

Las células son las unidades fundamentales de la biología. Apenas pues las células tienen diferencias cuando usted comienza a observar los niveles de proteínas en ellas o la serie de la DNA en células aparentemente idénticas, cuando usted observa las únicas moléculas, usted también ve una distribución de comportamientos.

Ahora somos en el escenario donde tenemos las tecnologías y la resolución de comenzar a observar estas clases de diferencias individuales entre los comportamientos de moléculas individuales y las células individuales. Pienso que va a reescribir ciertamente algunos de los libros de texto en campos tales como bioquímica y biología porque no hay cosa tal como una molécula media o una célula media. Cada célula tiene su propia identidad. Cada molécula tiene su propia identidad.

Estos comportamientos se han tratado previamente como propiedades medias de moléculas y de células. El comportamiento estocástico de moléculas individuales puede tener implicaciones importantes que afecten a procesos bioquímicos, a caminos y final a las propiedades de células individuales. Y usted puede comenzar a observar estos caminos y procesos y conjetura cómo las propiedades de moléculas individuales se manifiestan en el nivel unicelular.

¿Qué avances en tecnología usted tiene gusto de ver y porqué?

Una cosa que quisiera que continuara en mi laboratorio debo activar el límite de la sensibilidad para descubrir incluso concentraciones más inferiores que nosotros hemos podido lograr hasta ahora. Cuál hemos podido lograr hasta ahora es medir las proteínas en dos a tres órdenes de magnitud baja la concentración. Sería grande buscar otros diez a de cien veces más sensibilidad.

Hay mucho más cosas que podremos observar con un de alto nivel de la sensibilidad. Incluso hoy, cuando estamos midiendo muestras de sangre, no vemos ciertas proteínas porque la tecnología del análisis de Simoa, incluso con su sensibilidad mil veces más alta, no nos da la sensibilidad que necesitamos para medir algunas de las moléculas presentes en la sangre en niveles más inferiores de la expresión. Quisiera ver el movimiento continuado de ese límite de detección más inferior a los niveles aún más sensibles.

También pienso que sería grande poder aumentar el nivel de multiplexación para poder medir más moléculas de diversos tipos simultáneamente.

Entonces finalmente, y éste es algo que no tengo una solución de la tecnología para pero ciertamente algo que quisiera ver, yo quisiera poder comenzar a aplicar esta clase de tecnología que cuenta molecular a las pequeñas moléculas. Utilizamos los immunoensayos y los análisis del ácido nucléico que están capturando las moléculas grandes, pero la tecnología que hemos desarrollado no es realmente favorable a poder medir las pequeñas moléculas tales como metabilitos. Sería obviamente grande poder hacer eso.

¿Dónde pueden los programas de lectura encontrar más información?

El campo está cambiando tan rápidamente que la mejor cosa a hacer es simple búsqueda para “Simoa”, y habrá cientos artículos donde la tecnología utilizado para los diversos usos.

Sobre profesor David Walt

WALT DE DAVID

David R. Walt es el catedrático, profesor de la química, profesor de la genética, profesor de la ingeniería biomédica en la universidad de los penachos y es profesor del Howard Hughes Medical Institute. Él recibió un B.S. en química de la Universidad de Michigan y un Ph.D. en biología química de SUNY en el arroyo pedregoso.

Su laboratorio promovió el revelado de las matrices del microwell, que dieron lugar al descubrimiento de las matrices de la moldura que revolucionaron el campo del análisis genético. El laboratorio del Dr. Walt también expuso la idea de la detección digital de la proteína desarrollando una alta tecnología de la producción para realizar único análisis de la molécula.

Los actuales esfuerzos en el laboratorio se dirigen que miden la variación de la proteína y de la expresión génica en células, estudios fundamentales de las poblaciones de únicas moléculas de la enzima y de únicos nanoparticles, así como la detección ultrasensible de los biomarkers para el cáncer, la enfermedad infecciosa, y los agentes biológicos de la amenaza.

El Dr. Walt es el fundador científico y director anterior de Illumina Inc. y el fundador científico y director de Quanterix Corp. que él es director de Cerulean Pharma Inc. y Exicure, Inc. así como fundador y director de Ultivue, Inc. y de las biotecnologías del árbol.

Él sirvió previamente como copresidencia de la National Academy of Sciences la tabla en ciencias y tecnología químicas. El Dr. Walt ha publicado sobre 300 papeles par-revisados y tiene sobre 75 patentes publicadas de los E.E.U.U.

Él ha recibido las recompensas y los honores nacionales y del international numerosos para su trabajo fundamental y aplicado en el campo de matrices ópticas y de únicas moléculas incluyendo la sociedad de substancia química americana (ACS) Kathryn C. Hach Award para el éxito emprendedor (2017), Rafael N. Adams Award en la química de Bioanalytical (2016), recompensa de Gustavus Juan Esselen (2014), recompensa del análisis de Spectrochemical de la química analítica (2013), la recompensa de la química analítica de Pittsburgh (2013), y la recompensa nacional de ACS para la invención creativa (2010).

Él es una pieza de la academia de ingeniería nacional y de la academia nacional de remedio, de una persona de la academia americana de artes y de ciencias, de una persona del instituto americano para la ingeniería médica y biológica, y de una persona de la academia nacional de inventores.

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