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Anticorpos de decifração com a proteína da próxima geração que arranja em seqüência a tecnologia

insights from industryMingjie XieCEORapid Novor

Uma entrevista com Mingjie Xie, conduzido por James Ives, MPsych

Dê por favor uma vista geral da proteína da próxima geração que arranja em seqüência (NGPS) e como pode ser usada para decifrar proteínas do anticorpo.

Arranjar em seqüência da proteína da próxima geração ou NGPS são a tecnologia para derivar as seqüências completas da proteína directamente das amostras da proteína usando a espectrometria em massa. O objetivo da tecnologia é determinar exactamente a seqüência preliminar da proteína na amostra dada.

Crédito: ustas7777777/Shutterstock.com

Arranjar em seqüência proteínas do anticorpo é um dos melhores pedidos para a tecnologia de NGPS. Os anticorpos são um tipo especial de proteínas geradas por nosso sistema imunitário para proteger-se contra agentes estrangeiros.

O sistema imunitário funciona em uma maneira fascinante. Pode responder rapidamente a um antígeno gerando os anticorpos limitados especificamente a ele. Isto é feito, na parte, pelo mecanismo assim chamado da recombinação de V (D) J, que conduz às seqüências “aleatórias” em determinadas áreas das proteínas do anticorpo, conhecidas como as regiões dedeterminação, ou ao CDRs.

Esta aleatoriedade faz a cada anticorpo original e faz eficazmente todas as seqüências em quaisquer bases de dados untrustworthy. Por este motivo, NGPS será usado para determinar as seqüências da corrente pesada e clara.

O conceito geral e o procedimento para nosso arranjar em seqüência da proteína do anticorpo de REmAb™ contêm quatro etapas principais.

Etapa uma, nós digerimos a proteína do anticorpo usando enzimas múltiplas. Nós escolhemos com cuidado o grupo de enzimas que têm as regras muito diferentes da estaca para aumentar a diversidade de local da digestão.

Etapa dois, nós executamos as amostras através do instrumento da precisão da massa alta, em nosso caso, um Q Thermo Exactive, e geramos centenas de milhares de espectros em tandem.

Etapa três, nós executamos o peptide de novo que arranja em seqüência usando nosso próprio motor de Novor para converter o espectro em seqüências do peptide.

Finalmente em etapa quatro, nós montamos aquelas seqüências do peptide na seqüência completa da proteína.

Que são a corrente a bandeira de ouro usada para detectar proteínas do anticorpo e como ele comparam a NGPS?

A resposta é, ele depende. Actualmente se você tem o acesso à linha celular que expressa o anticorpo, ir ao método é usar o DNA/RNA que arranja em seqüência tecnologias baseadas para derivar indirectamente as seqüências da proteína do anticorpo.

Se você não tem o acesso à linha celular, arranjar em seqüência da proteína da próxima geração é a única maneira de obter a informação exacta da seqüência do anticorpo.

Que as vantagens chaves da proteína da próxima geração estão arranjando em seqüência? Que desvantagens há?

Quando a linha celular é acessível, o ADN que arranja em seqüência e as tecnologias de NGPS podem ser usadas para determinar as seqüências do anticorpo.

As proteínas são as moléculas funcionais nas pilhas. Arranjar em seqüência da proteína da próxima geração (NGPS) utiliza a tecnologia da espectrometria em massa para medir directamente as proteínas ou os polipeptídeos. Devido a esta medida directa, pode detectar as variações inesperadas, as alterações do cargo e os glycosylations translational etc. Aquelas mudanças do nível da proteína não podem ser detectadas pelo ADN que arranja em seqüência a tecnologia.

 

No anticorpo que arranja em seqüência a aplicação, devido à “aleatoriedade” da região variável, especialmente as seqüências da região dos CDR, ADN que arranja em seqüência a tecnologia não podem trabalhar em alguns anticorpos de todo.

Ser uma tecnologia emergente, a produção de NGPS é ainda consideravelmente mais baixo do que arranjar em seqüência do ADN. O custo tinha deixado cair significativamente nos dois anos passados, mas ainda vê-se como uma barreira para uma adopção mais larga quando a linha celular é acessível.

Que serviços RapidNovor oferece para arranjar em seqüência da proteína do anticorpo?

Nós oferecemos nosso REmAb™ que arranja em seqüência o serviço em três pacotes diferentes.

O pacote básico de REmAb™ dar-lhe-á a corrente pesada e clara exacta seqüências completos. Mas há uma advertência; A leucina e o Isoleucine têm a massa idêntica. Somente pressupor no pacote básico. Isto significa que os clientes estão incentivados expressar formulários múltiplos do anticorpo para cobrir todas as posições da leucina/Isoleucine nas regiões dos CDR para assegurar o sucesso da ligação.

O segundo pacote é REmAb™ com tecnologia de WILD™. WILD™ representa a determinação do Isoleucine/leucina do W-íon. Esta tecnologia utiliza o espectrómetro em massa o mais avançado no mercado e pode determinar a leucina e o Isoleucine baseados exactamente no w-íon observado nas experiências.

Com a tecnologia de WILD™, os w-íons são usados para determinar cada posição da leucina/Isoleucine na região variável das seqüências da corrente pesada e clara, não deixando nenhuma necessidade de expressar na maioria dos casos formulários múltiplos.

O terceiro pacote é arranjar em seqüência completo mais o serviço da expressão. Os clientes podem usar este serviço como um sistema de balcão único: receberão as proteínas de recombinação do anticorpo que trabalham apenas como originais.

Dá por favor uma breve vista geral da determinação da leucina do Isoleucine do W-íon (WILD™), como faz a proteína do anticorpo que arranja em seqüência mais específico/exacto?

a determinação do Isoleucine/leucina do W-íon ou WILD™ são o primeiro serviço disponível no comércio para distinguir exactamente os dois ácidos aminados isomeric em uma maneira da alto-produção usando a espectrometria em massa.

Embora o mecanismo que usa w-íons para diferenciar distante os dois ácidos aminados fosse descrito na literatura científica 30 anos há, tornou-se somente um tanto prático nos últimos anos com o avanço da instrumentação e diversos papéis foram publicados assim com protocolos diferentes da experiência para endereçar o problema.

A lentidão da revelação comercial desta tecnologia está na parte devido à falta da necessidade em aplicações reais. Por exemplo, a pesquisa da base de dados é um do método o mais de uso geral para identificar proteínas.

as proteínas do Não-anticorpo são na maior parte bastante conservadoras no termo de suas seqüências preliminares, não mudam nem não se transformam muito frequentemente. Por este motivo, confiar os ácidos aminados na base de dados da seqüência faz o sentido.

Mas arranjar em seqüência proteínas do anticorpo é uma história totalmente diferente, devido à presença das regiões hyper-variáveis dos CDR. Arranjar em seqüência de novo do Peptide é o método final para figurar para fora as seqüências no CDRs, com a somente uma edição deixada, a leucina e o Isoleucine isomeric.

Nossa tecnologia de WILD™ encheu a última parte do enigma. A tecnologia de WILD™ é desenvolvida com base no mesmo mecanismo publicado no papel, com os protocolos da análise da experiência e de dados ajustado para ser robusta e alto-produção.

Com WILD™ nós agora podemos conseguir a precisão da seqüência de 100% sem nenhumas advertências.

Por que é importante ter a determinação exacta de ácidos aminados isomeric como o Isoleucine e a leucina?

Embora o Isoleucine e a leucina tenham o mesmo peso molecular, tem estruturas diferentes. Esta diferença na estrutura causará diferenças em actividades biológicas. No contexto dos anticorpos, o Isoleucine e a leucina nas regiões dos CDR podem significativamente afectar a afinidade obrigatória e a especificidade dos anticorpos.

Antes da chegada de WILD™, a expressão de formulários múltiplos do anticorpo é exigida geralmente para certificar-se que real é incluído. Isto não é sempre econômico ou mesmo prático. O número de formulários exigidos para ser expressado é exponencial comparado ao número de posições do Isoleucine/leucina nos seis CDRs.

Em alguns casos infelizes, o custo para expressar todos os formulários permutated pode ser proibitivo. Em um projecto recente nós terminamos, lá fomos 9 posições do Isoleucine/leucina no CDRs. Sem WILD™, o cliente teria que expressar 512 formulários para cobrir todas as possibilidades.

WILD™ derrubou este número a 1. Isto não somente reduzido significativamente o custo da expressão, mas igualmente salvar os grandes quantidades de tempo e de esforço de modo que pudessem se centrar sobre sua pesquisa.

Como exacto é arranjar em seqüência da proteína do anticorpo? Confia em seqüências da homologia?

Esta é uma grande pergunta. A proteína do anticorpo que arranja em seqüência, quando feita correctamente, é muito exacta. Isto foi confirmado por muitos clientes. Os anticorpos de recombinação comportam-se exactamente o mesmos que originais.

Eu estou contente que você traz acima a pergunta da seqüência da homologia. Esta é realmente uma mais frequentemente das perguntas feitas por nossos clientes. A resposta é NÃO. Nós não confiamos em seqüências da homologia. Esta é de facto uma diferenciação chave para nosso REmAb™ que arranja em seqüência a tecnologia.

Confiar em seqüências da homologia no processo arranjando em seqüência é perigosa e pode introduzir erros, especialmente em e à volta das regiões dos CDR. Como mencionado mais cedo, a natureza da aleatoriedade das seqüências nas regiões dos CDR faz todas as seqüências da base de dados untrustworthy. Nós vimos este muitas vezes em que “fixando” as seqüências arranjadas em seqüência inicialmente por outro.

Muitas diferenças subtis nas seqüências, tais como uma troca de alguns ácidos aminados, não podem afectar a cobertura da proteína no peptide que traça de todo.

Para assegurar a precisão arranjando em seqüência, nós desenvolvemos uma contagem da qualidade para cada ácido aminado nas seqüências da proteína do anticorpo em nossa plataforma de REmAb™. A contagem é uma reflexão da evidência que efectiva nós observamos dos dados.

Diz nossos cientistas no tempo real se qualquer parte das seqüências do anticorpo pode conter erros, ou em algum outro menos seguro dos casos devido ao insuficiente sinal nos dados. Nós igualmente instilamos diversas melhores práticas em nosso processo arranjando em seqüência assegurar mais a qualidade.

1. Examine ácidos aminados individuais
2. Pague a atenção ao CDRs, especialmente a corrente pesada CDR3
3. Distinga a leucina e o Isoleucine usando o método do w-íon

Que aplicações há para NGPS? Que aplicações mais adicionais há com especificidade adicionada de WILD™?

Como uma nova tecnologia emergente, as aplicações de arranjar em seqüência da proteína da próxima geração são ainda pela maior parte inexploradas. Nós temos investido pesadamente no mercado para deixar mais cientistas saber sobre a existência da tecnologia. Os cientistas inventarão maneiras novas de usá-la.

Nós salvamos muitos anticorpos úteis para nossos clientes onde os anticorpos foram gerados inicialmente há muitos anos e as linha celular foram perdidas ou já não rastreável.

Nós ajudamos os anticorpos da seqüência dos clientes que são difíceis de arranjar em seqüência usando o ADN que arranja em seqüência técnicas. Nós igualmente ajudamos clientes a confirmar as seqüências que já têm por cega e independente arranjando em seqüência as proteínas do anticorpo.

As ajudas da tecnologia de WILD™ removem a última advertência de arranjar em seqüência da proteína da próxima geração. Remove as incertezas nas atribuições isomeric dos ácidos aminados e faz a maioria das aplicações mais práticos e econômicos.

Que o futuro guardara para NGPS? Que avanços você espera ver em um futuro próximo?

O avanço de arranjar em seqüência da proteína da próxima geração estará em duas dimensões: a produção e a complexidade.

Na dimensão da produção, a automatização nas experiências e na análise de dados jogará um papel importante. Nós estamos investindo na robótica e no líquido automatizado que seguram para estandardizar nossas experiências das especs. da massa. Nós somos igualmente tornar-se automatizado arranjando em seqüência os algoritmos que podem reduzir o tempo de análise dos dados dos dias às actas.

Na dimensão da complexidade, o objectivo último é arranjar em seqüência os anticorpos polyclonal do sangue. Para conseguir o objetivo, o investimento significativo na investigação e desenvolvimento das experiências e os algoritmos são exigidos.

A proteína que arranja em seqüência, particularmente nossa tecnologia da próxima geração de REmAb™, é mmoída quebrar. Isto está a primeira vez no mundo que cientistas pode confiantemente e rotineiramente arranjar em seqüência algumas proteínas dadas.

Isto é análogo à invenção do genoma que arranja em seqüência a tecnologia, que permitiu uma indústria inteira e mudou fundamental a pesquisa da biologia e da saúde da conduta dos povos da maneira. Agora nós somos em uma situação similar onde arranjar em seqüência da proteína da alto-produção se torne possível. Nós somos bem posicionados fazer esta mudança à comunidade científica.

Onde podem os leitores encontrar mais informação?

Nosso Web site, www.rapidnovor.com, é um grande recurso para relativo à informação à proteína da próxima geração que arranja em seqüência, particularmente na aplicação do anticorpo.

Sobre Mingjie Xie

O Sr. Mingjie Xie, CAM, MBA, é o co-fundador e o CEO de Novor rápido Inc. É um cientista de computador treinando andreceived seu grau do CAM da universidade ocidental no campo da bioinformática.

Recebeu seu grau do MBA da escola de Richard Ivey do negócio para levar a cabo seus interesses no negócio. Antes de co-fundar Novor rápido Inc, Mingjie é ARRULHAR de uma empresa de software da bioinformática.

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