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Avances dans l'analyse de lignée de cellules

Thought LeadersDr. Jan Philipp Junker Group Leader of The Junker LabMax-Delbrück Center for Molecular Medicine

Une entrevue avec le vieux clou de M. janv. Philipp, PhD, conduit par Kate Anderton, BSC

Pourquoi est-il important d'étudier la lignée de cellules ?

Il y a une énorme quantité de diversité dans les types de cellules des organismes de corps humain et de modèle. Nous avons soupçonné pendant longtemps ceci mais le développement récent du transcriptomics unicellulaire nous a permis de le prouver. Si nous voulons comprendre comment ce niveau de diversité est produit, nous devons produire des méthodes neuves pour étudier la lignée de cellules.

Crédit : Yurchanka Siarhei/Shutterstock.com

Le traçage de lignée est réellement un inducteur très vieil qui remonte au 19ème siècle, mais de ce que nous avons besoin maintenant sont les voies d'étudier l'identité des cellules et de leur origine simultanément, sur une échelle organisme organisme. Cette information nous permettra de promouvoir notre compréhension d'origine des maladies type-dépendantes de cellules aux lesquelles sont liés, par exemple, l'absence ou la sur-prolifération de certains types de cellules.

Quelles sont les cicatrices génétiques ? Pourquoi il a-t-les été difficile étudier dans le passé ?

Pour étudier la lignée de cellules que nous devons ajouter des bornes, ou les « codes barre », aux cellules. Il y a quelques différentes approches que les gens introduisaient des bornes. Une méthode qui a été précédemment employée est transfection virale, mais cette technique a quelques limitations concernant sa gamme d'application.

La voie que nous la faisons est par l'utilisation de CRISPR-Cas9. Nous produisons une interruption de double-boucle dans un transgène de sorte que nous ne brisions rien qui est important pour la viabilité des cellules. Les cellules effectuent de petites erreurs quand la réparation de la double-boucle se brise. La lésion est réparée, mais pas parfaitement, produisant de petites mises en place ou omissions autour du site de coupure. Est ce ce que nous appelons une cicatrice génétique.

Il s'avère que ces cicatrices sont quelque peu variables dans leur longueur et positionnent. Une fois la cicatrice a été produite, il est stable et permanent, la signification de lui sera héritée par toutes les cellules de descendant. Ceci nous permet d'employer codes barre génétiques de lignée de cicatrices.

Pourquoi il a-t-les été difficile étudier dans le passé ? Bien, CRISPR-Cas9 est une technique neuve qui était précédemment indisponible, mais l'autre élément important est de pouvoir donner lecture ces cicatrices au niveau unicellulaire, qui a grâce tout récemment étée d'une possibilité au développement de la cellule-génomique unique.

Veuillez donner votre recherche actuelle dans le domaine de la génomique unicellulaire.

Mon équipe de recherche se concentre sur essayer de comprendre l'hétérogénéité de différents types de cellules utilisant le transcriptomics unicellulaire. En caractérisant la transcription des cellules, nous pouvons recenser des types de cellules et analyser ce qui les rend distinctes. Nous employons actuel le traçage de la lignée CRISPR-Cas9 pour développer des stratégies nouvelles pour comprendre l'origine des types de cellules.

Mon laboratoire est un laboratoire relativement jeune. Nous avons commencé au sujet il y a de 2 et demi années et notre papier récent sur le traçage de la lignée CRISPR-Cas9 est le premier papier important que nous avons publié.

L'autre travail que nous effectuons dans le cadre de la génomique unicellulaire et le transcriptomics unicellulaire est d'ajouter des informations sur l'espace, en plus des informations sur le temps. C'est transcriptomics spatial-resolved appelé et nous avons récent inventé un tomo-seq appelé de technique pour faire ceci.

Dans ARN-seq, vous type n'avez pas la résolution spatiale. Ceci concerne dissoudre le tissu ou l'organe dans un solvant et analyser les cellules dans lui. Si vous analysez les cellules d'un tissu en vrac ou comme cellules, vous n'avez pas l'accès direct à l'information spatiale.

Dans tomo-seq, nous prélevons un échantillon, par exemple un embryon de zebrafish, et puis le coupons en parts minces. Utilisant un cryotome, nous pouvons sectionner l'embryon dans beaucoup de parts minces et ordonnancer l'ARN de chaque part séparé.

Cette méthode nous fournit l'information spatiale que nous pouvons employer pour recenser des configurations d'expression du gène d'une façon complet impartiale.

En 2014, nous avions l'habitude tomo-seq de découvrir les gènes neufs qui sont exprimés en certains organes ou structures embryonnaires.

Pourquoi employant CRISPR-Cas9 pour étudier la lignée de cellules est-il un tel avancement ?

Dans notre étude, nous avons simplement injecté Cas9 et l'ARN de guide, mais la souplesse d'utilisation des moyens CRISPR-Cas9 que vous pourriez insérer un gène Cas9 chimique-inductible dans le génome, te permettant de déclencher le système à intervalles de développement spécifiques.

Le système est également beaucoup plus polyvalent si comparé à d'autres systèmes où vous, par exemple, comptez sur la transfection ou la greffe virale. La capacité de prendre un système exogène, comme Cas9, que nous comprenons tout à fait bon maintenant, et a mis ceci dans les cellules comme enregistreur, ajoute un grand nombre de souplesse.

Le fait qu'il produit cette énorme diversité de codes barre est très utile de sorte que nous puissions tracer des lignées des milliers de cellules du même animal. Ceci n'a pas pu n'être fait avec aucune autre méthode facilement. Par exemple, des journalistes fluorescents sont limités par le nombre de couleurs procurables. Vous pouvez employer différentes combinaisons de ces couleurs, mais bien rapidement vous manquez de définition spectrale.

Avec Cas9, vous pouvez tracer des lignées de cellules utilisant l'information de séquence, qui augmente votre capacité de multiplexage massivement. D'une manière primordiale, cette approche nous permet également de recenser simultanément des types de cellules en mesurant les transcriptomes unicellulaires.

Embryons de Zebrafish. Crédit : Weber de Micha/Shutterstock.com

Quelles conclusions peuvent être effectuées au sujet d'employer CRISPR-Cas9 pour étudier la lignée de cellules ?

Le traçage de CRISPR Cas9-lineage est un domaine d'études apparaissant. Cependant, il y a également beaucoup d'autres idées nouvelles actuel trialed pour le traçage de lignée. Jusqu'ici, l'orientation a été sur déterminer cette méthode et sur confirmer les découvertes précédentes qui ont employé d'autres techniques afin de valider l'utilisation de CRISPR. Nous commençons seulement juste à l'employer pour obtenir des découvertes biologiques nouvelles.

Nous voyons déjà le roman, les configurations intéressantes et les fractionnements de lignée dans les organes comme le coeur ou le pancréas des zebrafish. Vers la même époque en tant que nous, deux autres groupes, laboratoire d'Alex Schier et laboratoire d'Alexandre van Oudenaarden's, études publiées utilisant CRISPR-Cas9 pour le traçage de lignée et cellule simultanée tapent l'identification. Ils ont employé des stratégies et des systèmes légèrement différents, mais le concept fondamental est identique.

Je suis sûr que traçage de la lignée CRISPR/Cas9 sera employé pour effectuer beaucoup de découvertes intéressantes à l'avenir concernant l'origine des types de cellules ou comment les arbres de lignée règlent sur la perturbation, mais en ce moment nous sommes toujours dans les stades précoces.  

Comment cette technique a-t-elle pu être employée pour élargir notre connaissance au sujet des maladies humaines ?

Je vois deux types d'applications dans les systèmes modèles qui peuvent améliorer notre compréhension de la maladie humaine. On serait des défectuosités de développement où des choix de destin de cellules sont changés tôt à l'étude dû à une mutation. Le deuxième type d'étude serait de vérifier la réaction d'un tissu à des blessures ou à une perturbation différente, afin de comprendre comment les destins de cellules changent dans de telles conditions.

Je pense qu'il est important de noter que nous ne pouvons pas nous appliquer CRISPR-Cas9 aux patients humains. Ainsi, nous devons employer les organismes modèles tels que les zebrafish, ou potentiellement, les organoids humains. Ce dernier seraient une avenue très intéressante à l'explorer.

Quelles sont les prochaines opérations pour votre recherche ?

Il reste beaucoup de travail à faire à un niveau expérimental et de calcul. Quant à l'aspect de calcul, maintenant que nous avons ces arbres de lignée, nous devons découvrir ce que nous pouvons apprendre de eux. Comment est-ce que pouvons-nous nous condenser cette information, ou des analyses statistiques sur ces arbres, comprenons quand des décisions de développement sont prises ?

Au niveau expérimental, nous commençons juste à explorer les applications du traçage de la lignée CRISPR-Cas9 pour comprendre le mécanisme des maladies. Je pense également que beaucoup de développement de méthode reste à faire. En ce moment, nous injectons Cas9 et l'ARN de guide à l'une étape de cellules, pour nous permettre d'enregistrer les divisions cellulaires très premières.

Nous devons améliorer la méthode de sorte que nous puissions déclencher le système d'enregistrement de la lignée CRISPR-Cas9 beaucoup plus tard. Par exemple, si vous voulez étudier l'infarctus du myocarde dans les zebrafish, il serait bien mieux marquer des cellules plus tard dans l'adulte. Ainsi, nous travaillons actuel sur les systèmes se développants pour gagner de plus haut niveau du contrôle du système d'enregistrement.

Où peuvent les lecteurs trouver plus d'informations ?

Le laboratoire de vieux clou

Au sujet de M. Junker

M. Junker reçu un diplôme de son PhD en biophysique chez le Technische Universität München, Allemagne, en 2009 et a continué pour compléter des camaraderies post-doctorales à Massachusetts Institute of Technology, aux Etats-Unis, et à l'institut de Hubrecht, Utrecht, Pays-Bas.

M. Junker a repris la position du chef de groupe au centre Maximum-Delbrück pour le médicament moléculaire, Berlin, Allemagne, en 2016, et se concentre actuel sur développer des techniques nouvelles pour la biologie du développement quantitative.

Kate Anderton

Written by

Kate Anderton

Kate Anderton is a Biomedical Sciences graduate (B.Sc.) from Lancaster University. She manages the editorial content on News-Medical and carries out interviews with world-renowned medical and life sciences researchers. She also interviews innovative industry leaders who are helping to bring the next generation of medical technologies to market.

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