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Avanzamenti nell'analisi di stirpe delle cellule

Thought LeadersDr. Jan Philipp Junker Group Leader of The Junker LabMax-Delbrück Center for Molecular Medicine

Un'intervista con il junker di Dott. gennaio Philipp, PhD, condotto da Kate Anderton, BSc

Perché è importante studiare lo stirpe delle cellule?

C'è una quantità enorme di diversità nei tipi delle cellule del corpo umano e degli organismi di modello. Abbiamo sospettato a lungo questo ma lo sviluppo recente del transcriptomics unicellulare ha permesso che noi lo provassimo. Se vogliamo capire come questo livello di diversità è creato, dobbiamo generare i nuovi metodi per studiare lo stirpe delle cellule.

Credito: Yurchanka Siarhei/Shutterstock.com

Il tracciato di stirpe è realmente un campo molto vecchio che data dal diciannovesimo secolo, ma di che cosa ora abbiamo bisogno sono i modi studiare simultaneamente l'identità delle celle e della loro origine, su un disgaggio organismo di ampiezza. Questi informazioni permetteranno che noi avanziamo la nostra comprensione dell'origine delle malattie tipo-dipendenti delle cellule a cui sono collegati, per esempio, l'assenza o la sovra-proliferazione di determinati tipi delle cellule.

Che cosa sono cicatrici genetiche? Perché sono stati difficili da studiare nel passato?

per studiare stirpe che delle cellule dobbiamo aggiungere gli indicatori, o “i codici a barre„, alle celle. Ci sono una coppia di approcci differenti che la gente ha usato per presentare gli indicatori. Un metodo che precedentemente è stato usato è transfezione virale, ma questa tecnica presenta alcune limitazioni per quanto riguarda il suo intervallo dell'applicazione.

Il modo che lo facciamo è con l'uso di CRISPR-Cas9. Criamo un doppio filo irrompiamo un transgene in modo che non rompiamo nulla che sia importante per l'attuabilità delle celle. Le celle rimpiccioliscono gli errori quando riparare il doppio filo si rompe. La lesione è riparata non perfettamente, ma, generando le piccole inserzioni o eliminazioni intorno al sito del taglio. Ciò è che cosa chiamiamo una cicatrice genetica.

Risulta che queste cicatrici sono in qualche modo variabili nella loro lunghezza e posizionano. La cicatrice è stata creata una volta, è stabile e permanente, significarlo sarà ereditato da tutte le cellule figlie. Ciò permette che noi usiamo i codici a barre genetici di stirpe delle cicatrici.

Perché sono stati difficili da studiare nel passato? Bene, CRISPR-Cas9 è una nuova tecnica che era precedentemente non disponibile, ma l'altra componente importante è di potere leggere fuori queste cicatrici al livello unicellulare, che ha soltanto grazie recentemente diventati di una possibilità allo sviluppo di singola cella-genomica.

Descriva prego la vostra ricerca corrente nel campo di genomica unicellulare.

Il mio gruppo di ricerca mette a fuoco sulla prova di capire l'eterogeneità dei tipi differenti delle cellule facendo uso del transcriptomics unicellulare. Caratterizzando la trascrizione degli unicellulari, possiamo identificare i tipi delle cellule ed analizzare che cosa le rende distinte. Corrente stiamo usando il tracciato di stirpe CRISPR-Cas9 per sviluppare le strategie novelle per capire l'origine dei tipi delle cellule.

Il mio laboratorio è un laboratorio relativamente giovane. Abbiamo cominciato circa 2 e 1/2 anni fa ed il nostro documento recente sul tracciato di stirpe CRISPR-Cas9 è il primo documento che importante abbiamo pubblicato.

L'altro lavoro che facciamo nel contesto di genomica unicellulare e il transcriptomics unicellulare è di aggiungere le informazioni su spazio, oltre ad informazioni su tempo. Ciò è chiamata transcriptomics spaziale-risolto e recentemente abbiamo inventato una tecnica chiamata tomo-seguente per fare questo.

In RNA-seguente, non avete tipicamente risoluzione spaziale. Ciò comprende dissolvere il tessuto o l'organo in un solvente ed analizzare le celle. Se analizzate le celle da un tessuto all'ingrosso o come unicellulari, non avete accesso diretto alle informazioni spaziali.

In tomo-seguente, preleviamo un campione, per esempio un embrione di zebrafish e poi lo tagliamo in fette sottili. Facendo uso di un cryotome, possiamo sezionare l'embrione in molte fette sottili ed ordinare esclusivamente il RNA da ogni fetta.

Questo metodo ci fornisce le informazioni spaziali che possiamo usare per identificare i reticoli di espressione genica in un modo completamente imparziale.

Nel 2014, abbiamo usato tomo-seguente per scoprire i nuovi geni che sono espressi in determinati organi o strutture embrionali.

Perché è usando CRISPR-Cas9 per studiare lo stirpe delle cellule un tal avanzamento?

Nel nostro studio, abbiamo iniettato semplicemente Cas9 ed il RNA della guida, ma la versatilità dei mezzi CRISPR-Cas9 potreste inserire un gene chimico-viscoelastico Cas9 nel genoma, permettendo che avviate il sistema ad intervalli inerenti allo sviluppo specifici.

Il sistema è egualmente molto più versatile una volta confrontato ad altri sistemi in cui voi, per esempio, conti che sulla transfezione o sul trapianto virale. La capacità di catturare un sistema esogeno, come Cas9, che capiamo abbastanza buono ora ed ha messo questa nelle celle come registratore, aggiunge un gran numero di flessibilità.

Il fatto che crea questa diversità enorme dei codici a barre è molto utile in moda da poterci rintracciare noi gli stirpi da migliaia di celle dallo stesso animale. Ciò non ha potuto essere fatta facilmente con qualunque altro metodo. Per esempio, i reporter fluorescenti sono limitati dal numero dei colori disponibili. Potete usare le combinazioni differenti di questi colori, ma esaurite abbastanza rapidamente la risoluzione spettrale.

Con Cas9, potete rintracciare gli stirpi delle cellule facendo uso di informazioni di sequenza, che aumentano in maniera massiccia la vostra capacità di multiplazione. D'importanza, questo approccio egualmente permette che noi identifichiamo simultaneamente i tipi delle cellule per la misurazione dei transcriptomes unicellulari.

Embrioni di Zebrafish. Credito: Micha Weber/Shutterstock.com

Che conclusioni possono essere fatte circa usando CRISPR-Cas9 per studiare lo stirpe delle cellule?

Il tracciato di CRISPR Cas9-lineage è un campo di studio emergente. Tuttavia, ci sono egualmente molte altre idee novelle corrente che sono trialed per il tracciato di stirpe. Finora, il fuoco è stato sull'instaurazione del questo metodo e sulla conferma dei risultati precedenti che hanno usato altre tecniche per convalidare l'uso di CRISPR. Stiamo cominciando soltanto appena usarlo per ottenere i risultati biologici novelli.

Già stiamo vedendo il romanzo, i reticoli interessanti e le spaccature di stirpe negli organi come il cuore o il pancreas degli zebrafish. Intorno allo stesso tempo di noi, altri due gruppi, laboratorio di Alex Schier e laboratorio di Alexander van Oudenaarden, hanno pubblicato gli studi facendo uso di CRISPR-Cas9 per il tracciato di stirpe ed il tipo simultaneo l'identificazione delle cellule. Hanno usato le strategie ed i sistemi leggermente differenti, ma il concetto di fondo è lo stesso.

Sono sicuro che tracciato di stirpe CRISPR/Cas9 sarà usato per fare molte scoperte interessanti in futuro per quanto riguarda l'origine dei tipi delle cellule o come gli alberi di stirpe regolano alla perturbazione, ma ora siamo ancora nelle fasi iniziali.  

Come ha potuto questa tecnica essere usata per allargare la nostra conoscenza circa le malattie umane?

Vedo due tipi di applicazioni in sistemi-modello che possono migliorare la nostra comprensione della malattia umana. Uno sarebbe difetti inerenti allo sviluppo dove le scelte di destino delle cellule sono cambiate presto in via di sviluppo dovuto una mutazione. Il secondo tipo di studio sarebbe di studiare la risposta di un tessuto alla lesione o ad un'altra perturbazione, per capire come i destini delle cellule cambiano in tali circostanze.

Penso che sia importante notare che non possiamo applicare CRISPR-Cas9 ai pazienti umani. Così, dobbiamo usare gli organismi di modello quale gli zebrafish, o potenzialmente, organoids umani. Gli ultimi sarebbero un viale molto interessante da esplorare.

Che cosa sono i punti seguenti per la vostra ricerca?

C'è ancora molto lavoro da fare ad un livello sperimentale e di calcolo. Per quanto riguarda l'aspetto di calcolo, ora che abbiamo questi alberi di stirpe, dobbiamo scoprire che cosa possiamo imparare da loro. Come possiamo condensare questi informazioni, o le analisi statistiche su questi alberi, capiamo quando le decisioni inerenti allo sviluppo sono prese?

Al livello sperimentale, stiamo cominciando appena ad esplorare le applicazioni del tracciato di stirpe CRISPR-Cas9 per capire il meccanismo di malattia. Egualmente penso che molto sviluppo di metodo resti fare. Ora, stiamo iniettando Cas9 ed il RNA della guida nell'una fase delle cellule, per permettere che noi registriamo le divisioni cellulari molto in anticipo.

Dobbiamo migliorare il metodo in moda da poterci avviare molto più successivamente noi il sistema di registrazione di stirpe CRISPR-Cas9. Per esempio, se volete studiare l'infarto miocardico in zebrafish, sarebbe molto meglio contrassegnare le celle successivamente nell'adulto. Così, corrente stiamo lavorando ai sistemi di sviluppo per il guadagno di più alto livello di controllo sopra il sistema di registrazione.

Dove possono i lettori trovare più informazioni?

Il laboratorio del junker

Circa Dott. Junker

Il Dott. Junker laureato dal suo PhD in biofisica al Technische Universität München, Germania, nel 2009 ed ha continuato a completare le amicizie postdottorali a Massachusetts Institute of Technology, ad U.S.A. ed all'istituto di Hubrecht, Utrecht, Paesi Bassi.

Il Dott. Junker ha preso la posizione della guida del gruppo al centro Massimo-Delbrück per medicina molecolare, Berlino, Germania, nel 2016 e corrente sta mettendo a fuoco sullo sviluppare le tecniche novelle per biologia dello sviluppo quantitativa.

Kate Anderton

Written by

Kate Anderton

Kate Anderton is a Biomedical Sciences graduate (B.Sc.) from Lancaster University. She manages the editorial content on News-Medical and carries out interviews with world-renowned medical and life sciences researchers. She also interviews innovative industry leaders who are helping to bring the next generation of medical technologies to market.

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