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Avanços na análise da linhagem da pilha

Thought LeadersDr. Jan Philipp Junker Group Leader of The Junker LabMax-Delbrück Center for Molecular Medicine

Uma entrevista com o Junker do Dr. janeiro Philipp, PhD, conduzido por Kate Anderton, BSc

Por que é importante estudar a linhagem da pilha?

Há uma quantidade enorme de diversidade nos tipos da pilha do corpo humano e dos organismos modelo. Nós suspeitamos este por muito tempo mas a revelação recente do transcriptomics da único-pilha permitiu que nós provassem-no. Se nós queremos compreender como este nível de diversidade está criado, nós precisamos de gerar métodos novos para estudar a linhagem da pilha.

Crédito: Yurchanka Siarhei/Shutterstock.com

O traçado da linhagem é realmente um campo muito velho que date do século XIX, mas o que nós precisamos agora são as maneiras de estudar simultaneamente a identidade das pilhas e da sua origem, em uma escala organismo-larga. Esta informação permitirá que nós promovam nossa compreensão da origem das doenças tipo-dependentes da pilha a que são ligados, por exemplo, a ausência ou a sobre-proliferação de determinados tipos da pilha.

Que são cicatrizes genéticas? Por que foram difíceis de estudar no passado?

Para estudar a linhagem que da pilha nós precisamos de adicionar marcadores, ou os “códigos de barras”, às pilhas. Há um par aproximações diferentes que os povos se usaram para introduzir marcadores. Um método que tem sido usado previamente é transfection viral, mas esta técnica tem algumas limitações em relação a sua escala da aplicação.

A maneira que nós a fazemos é com o uso de CRISPR-Cas9. Nós criamos uma ruptura da dobro-costa em um transgene de modo que nós não quebremos qualquer coisa que é importante para a viabilidade das pilhas. As pilhas fazem erros pequenos quando reparar a dobro-costa quebra. A lesão é reparada, mas não perfeitamente, gerando inserções ou supressões pequenos em torno do local do corte. Este é o que nós chamamos uma cicatriz genética.

Despeja que estas cicatrizes são um tanto variáveis de seu comprimento e posicionam. A cicatriz foi criada uma vez, ele é estável e permanente, significá-lo será herdado por todas as pilhas de filha. Isto permite que nós usem códigos de barras genéticos da linhagem das cicatrizes.

Por que foram difíceis de estudar no passado? Bem, CRISPR-Cas9 é uma técnica nova que seja previamente não disponível, mas o outro componente importante é poder ler para fora estas cicatrizes no nível da único-pilha, que tem somente agradecimentos recentemente tornados de uma possibilidade à revelação da única pilha-genómica.

Esboce por favor sua pesquisa actual no campo da genómica da único-pilha.

Minha equipa de investigação centra-se sobre a tentativa compreender a heterogeneidade de tipos diferentes da pilha usando o transcriptomics da único-pilha. Caracterizando o transcrito de únicas pilhas, nós podemos identificar tipos da pilha e analisar o que o faz distinto. Nós estamos usando actualmente o traçado da linhagem CRISPR-Cas9 para desenvolver estratégias novas para compreender a origem de tipos da pilha.

Meu laboratório é um laboratório relativamente novo. Nós começamos aproximadamente dois e uma metade anos há e nosso papel recente no traçado da linhagem CRISPR-Cas9 é o primeiro papel que importante nós publicamos.

O outro trabalho que nós fazemos no contexto da única genómica da pilha e o único transcriptomics da pilha é adicionar a informação sobre o espaço, além do que a informação sobre o tempo. Isto é chamado transcriptomics espacial-resolved e nós inventamos recentemente uma técnica chamada tomo-segs. para fazer isto.

Em RNA-segs., você tipicamente não tem a definição espacial. Isto envolve dissolver o tecido ou o órgão em um solvente e analisar as pilhas dentro dele. Se você analisa as pilhas de um tecido no volume ou como únicas pilhas, você não tem de acesso directo à informação espacial.

Em tomo-segs., nós tomamos uma amostra, por exemplo um embrião dos zebrafish, e cortamo-la então em fatias finas. Usando um cryotome, nós podemos seccionar o embrião em muitas fatias finas e arranjar em seqüência separada o RNA de cada fatia.

Este método dá-nos a informação espacial que nós podemos usar para identificar testes padrões da expressão genética em uma maneira completamente imparcial.

Em 2014, nós usamo-nos tomo-segs. para descobrir os genes novos que são expressados em determinados órgãos ou em estruturas embrionárias.

Por que é usando CRISPR-Cas9 para estudar a linhagem da pilha tal avanço?

Em nosso estudo, nós injectamos simplesmente Cas9 e o RNA do guia, mas a versatilidade dos meios que CRISPR-Cas9 você poderia introduzir um gene Cas9 químico-inducible no genoma, permitindo que você provoque o sistema em intervalos desenvolventes específicos.

O sistema é igualmente muito mais versátil quando comparado a outros sistemas onde você, por exemplo, confie no transfection viral ou na transplantação. A capacidade para tomar um sistema exógeno, como Cas9, que nós compreendemos bastante bom agora, e pôs esta nas pilhas como um registrador, adiciona uma grande quantidade de flexibilidade.

O facto de que cria esta diversidade enorme dos códigos de barras é muito útil de modo que nós possamos seguir linhagens dos milhares de pilhas do mesmo animal. Isto não podia ser feito com nenhum outro método facilmente. Por exemplo, os repórteres fluorescentes são limitados pelo número de cores disponíveis. Você pode usar combinações diferentes destas cores, mas bastante rapidamente você é executado fora da definição espectral.

Com Cas9, você pode seguir linhagens da pilha usando a informação da seqüência, que aumenta sua capacidade da multiplexação maciça. Importante, esta aproximação igualmente permite que nós identifiquem simultaneamente tipos da pilha medindo únicos transcriptomes da pilha.

Embriões de Zebrafish. Crédito: Micha Weber/Shutterstock.com

Que conclusões podem ser feitas sobre a utilização de CRISPR-Cas9 para estudar a linhagem da pilha?

O traçado de CRISPR Cas9-lineage é um campo de estudo emergente. Contudo, há igualmente muitas outras ideias novas que estão sendo trialed actualmente para o traçado da linhagem. Até agora, o foco estêve em estabelecer este método e em confirmar os resultados precedentes que usaram outras técnicas a fim validar o uso de CRISPR. Nós somente apenas estamos começando usá-lo para obter resultados biológicos novos.

Nós já estamos vendo a novela, testes padrões interessantes e separações da linhagem nos órgãos como o coração ou o pâncreas dos zebrafish. Em torno do mesmo tempo como nós, outros dois grupos, laboratório de Alex Schier e laboratório de Alexander camionete Oudenaarden, estudos publicados usando CRISPR-Cas9 para o traçado da linhagem e o tipo simultâneo identificação da pilha. Usaram estratégias e sistemas ligeira diferentes, mas o conceito subjacente é o mesmo.

Eu sou certo que traçado da linhagem CRISPR/Cas9 estará usado para fazer no futuro muitas descobertas interessantes em relação à origem de tipos da pilha ou como as árvores da linhagem ajustam à perturbação, mas agora nós estamos ainda nas fases iniciais.  

Como podia esta técnica ser usada para alargar nosso conhecimento sobre doenças humanas?

Eu ver dois tipos de aplicações nos sistemas modelo que podem melhorar nossa compreensão da doença humana. Um seria os defeitos desenvolventes onde as escolhas do destino da pilha são mudadas cedo durante o processo de desenvolvimento devido a uma mutação. O segundo tipo de estudo seria investigar a resposta de um tecido a ferimento ou a uma outra perturbação, a fim compreender como os destinos da pilha mudam sob tais circunstâncias.

Eu penso que é importante notar que nós não podemos aplicar CRISPR-Cas9 aos pacientes humanos. Assim, nós devemos usar os organismos modelo tais como os zebrafish, ou potencial, organoids humanos. Os últimos seriam uma avenida muito interessante a explorar.

Que são os passos seguintes para sua pesquisa?

Há ainda muito trabalho a ser feito em um nível experimental e computacional. A propósito do aspecto computacional, agora que nós temos estas árvores da linhagem, nós precisamos de encontrar o que nós podemos aprender delas. Como podemos nós condensar esta informação, ou análises estatísticas nestas árvores, compreendemos quando as decisões desenvolventes são feitas?

No nível experimental, nós apenas estamos começando a explorar as aplicações do traçado da linhagem CRISPR-Cas9 para compreender o mecanismo da doença. Eu igualmente penso que muita revelação do método permanece ser feita. Agora, nós estamos injectando Cas9 e o RNA do guia na fase de uma célula, para permitir que nós gravem divisões de pilha muito adiantadas.

Nós precisamos de melhorar o método de modo que nós possamos provocar o sistema de gravação da linhagem CRISPR-Cas9 muito mais tarde. Por exemplo, se você quer estudar o enfarte do miocárdio nos zebrafish, seria muito melhor etiquetar pilhas mais atrasadas no adulto. Assim, nós estamos trabalhando actualmente em sistemas tornando-se para ganhar de mais alto nível do controle sobre o sistema de gravação.

Onde podem os leitores encontrar mais informação?

O laboratório do Junker

Sobre o Dr. Junker

O Dr. Junker graduado de seu PhD na biofísica no Technische Universität München, Alemanha, em 2009 e foi sobre terminar bolsa de estudo pos-doctoral em Massachusetts Institute of Technology, em EUA, e no instituto de Hubrecht, Utrecht, os Países Baixos.

O Dr. Junker pegou a posição do líder do grupo no centro Máximo-Delbrück para a medicina molecular, Berlim, Alemanha, em 2016, e está centrando-se actualmente sobre desenvolver técnicas novas para a biologia desenvolvente quantitativa.

Kate Anderton

Written by

Kate Anderton

Kate Anderton is a Biomedical Sciences graduate (B.Sc.) from Lancaster University. She manages the editorial content on News-Medical and carries out interviews with world-renowned medical and life sciences researchers. She also interviews innovative industry leaders who are helping to bring the next generation of medical technologies to market.

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