Les scientifiques trouvent les suppositions des gens au sujet de la réparation de l'ADN après CRISPR éditant pour avoir tort

En dépit des grandes espérances et de l'investissement élevé dans la retouche du gène CRISPR-Cas9, les scientifiques ont toujours beaucoup pour se renseigner sur la façon dont cela fonctionne chez l'homme.

Dans le dernier exemple, l'Université de Californie, Berkeley, scientifiques a constaté que les suppositions des gens au sujet de la façon dont les cellules réparent le génome après que les bouts ADN des enzymes Cas9 soient erronés.

La découverte donne l'analyse dans pourquoi les travaux de retouche du gène CRISPR-Cas9 en presque chaque cellule ont remarquablement bien essayé, cependant pas avec la réussite égale en toutes les cellules. Et elle pourrait aider des chercheurs à amplifier le rendement avec lequel les cellules insèrent l'ADN neuf dans le génome - pour remplacer une mutation nuisible par la séquence d'ADN correcte, par exemple - et généralement retouche du coup sec CRISPR-Cas9 pour obtenir les résultats désirés.

« Si vous voulez traiter la drépanocytose, vos chances de succès sont inextricablement attachées au rendement par lequel vous pouvez remplacer le gène muté de cellule falciforme avec le correct, » ont dit le boursier post-doctoral Chris Richardson, le premier auteur d'Uc Berkeley d'un article décrivant les découvertes. « Si vous moissonnez million de cellules d'un patient et vous avez le régime de mise en place de 10 pour cent, ce n'est pas car bon comme si vous avez 30 à 40 pour cent. Pouvant manipuler ces cellules pour augmenter la fréquence de ce réglage homologie-dirigé de processus et appelé, excite. »

La « retouche de gène est très puissante, avec beaucoup de promesse, mais avec, jusqu'ici, beaucoup de test et erreur. La voie que cela fonctionne en cellules humaines a été une boîte noire avec beaucoup de suppositions, » a dit le maïs de Jacob d'auteur important, un professeur de complément d'Uc Berkeley de moléculaire et la biologie cellulaire. « Nous commençons finalement à obtenir une illustration de que se passe-t-il. »

Le maïs, Richardson et leurs collègues publieront leurs découvertes dans la question d'août de la génétique de nature de tourillon, accessible en ligne maintenant.

Le maïs était jusque récemment le directeur scientifique de la biomédecine dans l'institut génomique novateur, d'un programme de recherche du joint CRISPR entre Uc Berkeley et d'Uc San Francisco. Cette chute, il joindra la faculté d'ETH à Zurich, Suisse.

CRISPR se fonde sur la réparation de l'ADN

CRISPR-Cas9 est révolutionnaire à cause de la précision avec laquelle il autoguide dedans sur une séquence d'ADN spécifique hors des milliards dans le génome et fend la molécule d'ADN bicaténaire. Mais après celui, il incombe à la cellule pour réparer les dégâts.

Le réglage peut se produire de deux voies. Les enzymes peuvent piquer les extrémités balançantes de retour ensemble, qui a souvent comme conséquence un ou plusieurs bases - les synthons d'ADN - étant ajoutées ou effacées, perturbant le fonctionnement du gène. Alternativement, d'autres enzymes peuvent corriger l'interruption avec une monocaténaire de l'ADN qui apparie la séquence d'ADN en amont et en aval de la coupure. Une boucle d'ADN complémentaire est produite pour compléter le réglage de double-boucle.

L'ancien, extrémité-jointure non-homologue appelée, semble être les résultats les plus courants après la coupe de CRISPR. Ce dernier, réglage homologie-dirigé, se produit plus fréquemment dans quelques types de cellules que d'autres, et exige la présence d'une pièce d'ADN qui peut être employée pour corriger l'interruption. Les chercheurs souvent fournissent une pièce monocatenaire d'ADN et espèrent que la cellule l'emploie pour remplacer la séquence défectueuse par le neuf.

Les deux procédés sont un morceau mystérieux, cependant, et personne ne sait pourquoi correction de quelques cellules promptement dans l'ADN tandis que d'autres font tellement rarement.

« L'enthousiasme pour l'usage de CRISPR-Cas9 pour des applications médicales ou synthétiques de biologie est grand, mais personne ne sait réellement ce qui se produit après que vous le mettiez dans des cellules, » Richardson a dit. « Il disparaît et produit ces interruptions et vous comptez sur les cellules pour les fixer. Mais les gens ne comprennent pas réellement comment ce les travaux par processus. »

Pour découvrir qui les enzymes de réparation de l'ADN sont critiques au réglage homologie-dirigé après la coupe de CRISPR, Richardson et le maïs a utilisé une interférence appelée de la technique CRISPR (CRISPRi) pour assommer, un par un, plus de 2.000 gènes connus ou soupçonnés pour être impliqué dans la réparation de l'ADN, un fonctionnement critique à une cellule saine.

Étonnant, plusieurs des gènes que prouvé pour être important - réglage homologie-dirigé relâché spectaculaire quand ils ont été amortis - étaient impliqués dans un système important de réglage pas vraisemblablement impliqué dans le réglage de CRISPR.

Anémie de Fanconi

La voie concerne 21 protéines indépendantes et est appelée la voie d'anémie de Fanconi parce que, si des gènes l'uns des pour ces protéines est endommagés, les gens développent l'anémie de Fanconi, une maladie héréditaire rare mais sérieuse dans laquelle la moelle osseuse ne peut pas effectuer assez de globules sanguins neufs. Elle est associée aux anomalies congénitales et à un haut risque de cancer, y compris une possibilité de 10 pour cent de leucémie se développante dans l'enfance. Peu de patients vivent au delà de 30 ans.

La voie a été connue et étudiée pendant des décennies, mais on a en grande partie compris que répare un genre spécifique de dégâts d'ADN : Réticulations d'interstrand d'ADN, où un nucléotide sur un brin d'ADN colle fortement avec du nucléotide sur la boucle adjacente, nuire la réplication de l'ADN et détruire souvent la cellule. Les chercheurs pendant les années 1980 ont eu rapporté un lien entre le réglage homologie-dirigé et la voie d'anémie de Fanconi, mais elle avait été ignorée ou mal comprise, maïs remarquable.

« A basé sur notre travail, nous croient que la voie d'anémie de Fanconi joue un rôle important en fixant d'autres types de lésions aussi bien, mais sont meilleur compris comme voie que la double-boucle de réglages se brise, » Richardson a dit. « Après la retouche Cas9, la voie d'anémie de Fanconi est exigée si vous voulez insérer l'ADN neuf. »

L'importance de la voie d'anémie de Fanconi en réparant CRISPR divise des manetons en doute quelques demandes de règlement planification de CRISPR pour la maladie elle-même, cependant. Sans voie active d'anémie de Fanconi, les cellules peuvent ne pas pouvoir remplacer leurs gènes mutés par les gènes normaux après que Cas9 effectue une coupure.

En fait, le niveau de l'activité de la voie d'anémie de Fanconi peut affecter comment efficacement CRISPR peut insérer l'ADN dans une cellule spécifique. Les chercheurs ont conclu que, alors que l'extrémité-jointure est le mécanisme de réglage de défaut après qu'une interruption de double-boucle, la voie d'anémie de Fanconi concurrence elle, et que des résultats plus de forte activité le réglage homologie-dirigé et extrémité-en se joignant moins.

Traitements contre le cancer

Tandis que les découvertes aident des scientifiques mieux à comprendre les mécanismes de réparation de l'ADN en cellules humaines, elles pourraient également aider des chercheurs développant les traitements anticancéreux qui visent la réparation de l'ADN en cellules cancéreuses. Puisque d'autres facteurs semblent maintenant être impliqués dans le réglage des interruptions de double-boucle, cette recherche augmente la liste de protéines qui pourraient misregulated afin de visser la réparation de l'ADN en cellules cancéreuses et les rendre plus susceptibles de la mort.

Richardson a également trouvé celle-là des 21 protéines dans la voie, FANCD2, autoguide toujours dedans sur le site de l'interruption de double-boucle produite par CRISPR-Cas9, indiquant qu'il joue un rôle majeur en réglant la mise en place de l'ADN neuf dans le génome au site de coupure. FANCD2 pourrait être tordu pour amplifier la fréquence avec laquelle une cellule insère l'ADN par l'intermédiaire du réglage homologie-dirigé.

« En outre, puisque FANCD2 localise au site des interruptions Cas9, vous pouvez employer FANCD2 pour tracer où Cas9 coupe dans n'importe quel type de cellules, » Richardson avez dit. « Si vous éditez une population des cellules et vous voulez savoir sur où et les coupures de hors circuit-objectif sont, vous pouvez juste tracer où FANCD2 a été trouvé dans le génome et vous pouvez trouver les coupures. »

« La voie entière d'anémie de Fanconi affecte le reste entre l'extrémité-jointure et le réglage homologie-dirigé ; elle agit comme un cop de circulation, » Corn a dit. « Ainsi le génotype d'un patient affectera comment vous faites la retouche de gène. »

Source : http://news.berkeley.edu/2018/07/30/dna-repair-after-crispr-cutting-not-at-all-what-people-thought/