Os cientistas encontram as suposições do pessoa sobre o reparo do ADN após CRISPR que editam para ser errados

Apesar das grandes esperanças e do investimento alto no gene CRISPR-Cas9 que edita, os cientistas ainda têm muito para aprender sobre como trabalha nos seres humanos.

No exemplo o mais atrasado, o University of California, Berkeley, cientistas encontrou que as suposições do pessoa sobre como as pilhas reparam o genoma depois que o ADN da tesoura de chapa da enzima Cas9 é errado.

A descoberta dá a introspecção porque o gene CRISPR-Cas9 que edita trabalhos notàvel bem em quase cada pilha tentou, em embora não com sucesso igual em todas as pilhas. E poderia ajudar pesquisadores a impulsionar a eficiência com que as pilhas introduzem o ADN novo no genoma - para substituir uma mutação prejudicial com a seqüência correcta do ADN, por exemplo - e geralmente na emenda CRISPR-Cas9 que edita para obter o resultado desejado.

“Se você quer tratar a anemia da célula falciforme, suas oportunidades de êxito estão amarradas inextricably à eficiência com que você pode substituir o gene transformado da célula falciforme com correcto,” disseram o companheiro pos-doctoral Chris Richardson de Uc Berkeley, primeiro autor de um papel que descreve os resultados. “Se você colhe milhão pilhas de um paciente e você tem a taxa de uma inserção de 10 por cento, aquela não é porque bom como se você tem 30 a 40 por cento. Poder manipular aquelas pilhas para aumentar a freqüência deste processo, chamada reparo homologia-dirigido, é emocionante.”

Do “a edição gene é super-poderosa, com muita promessa, mas, até agora, muita tentativa e erro. A maneira que trabalha em pilhas humanas foi uma caixa negra com muitas suposições,” disse o milho de Jacob do autor principal, um professor da adjunção de Uc Berkeley de molecular e a biologia celular. “Nós estamos começando finalmente obter uma imagem do que está acontecendo.”

O milho, Richardson e seus colegas publicarão seus resultados na introdução de agosto da genética da natureza do jornal, acessível em linha agora.

O milho era até recentemente o director científico da biomedicina no instituto inovativo da genómica, de um programa de investigação da junção CRISPR entre Uc Berkeley e de Uc San Francisco. Esta queda, juntar-se-á à faculdade de ETH em Zurique, Suíça.

CRISPR confia no reparo do ADN

CRISPR-Cas9 é revolucionário devido à precisão com que dirige dentro em uma seqüência específica do ADN fora de biliões no genoma e fende a molécula dobro-encalhada do ADN. Mas após aquele, é até a pilha para reparar o dano.

O reparo pode acontecer em duas maneiras. As enzimas podem costurar as extremidades de oscilação para trás junto, que conduz frequentemente a umas ou várias bases - os blocos de apartamentos de ADN - que estão sendo adicionadas ou suprimidas, interrompendo a função do gene. Alternativamente, outras enzimas podem remendar a ruptura com uma única costa do ADN que combina a seqüência do ADN ascendente e a jusante do corte. Uma costa complementar do ADN é criada para terminar o reparo da dobro-costa.

O anterior, chamado fim-junta não-homólogo, parece ser o resultado o mais comum após a estaca de CRISPR. O último, reparo homologia-dirigido, acontece mais freqüentemente em alguns tipos de pilhas do que outro, e exige a presença de uma parte de ADN que possa ser usada para remendar a ruptura. Os pesquisadores frequentemente fornecem uma parte único-encalhada de ADN e esperam que a pilha a usa para substituir a seqüência defeituosa com o novo.

Ambos os processos são um bit misterioso, contudo, e ninguém sabe porque correcção de programa de algumas pilhas prontamente no ADN quando outro fizer tão rara.

“O entusiasmo para usar CRISPR-Cas9 para aplicações médicas ou sintéticas da biologia é grande, mas ninguém conhece realmente o que acontece depois que você o põe em pilhas,” Richardson disse. “Vai e cria estas rupturas e você conta nas pilhas para fixá-las. Mas os povos não compreendem realmente como os trabalhos desse processo.”

Para encontrar que as enzimas do reparo do ADN são críticas ao reparo homologia-dirigido após a estaca de CRISPR, Richardson e o milho empregou uma técnica chamada a interferência de CRISPR (CRISPRi) para bater para fora, um de cada vez, mais de 2.000 genes conhecidos ou suspeitados para ser envolvido no reparo do ADN, uma função crítica a uma pilha saudável.

Surpreendentemente, muitos dos genes que provaram ser importantes - reparo homologia-dirigido deixaram cair dramàtica quando foram silenciadas - foram envolvidos em um sistema importante do reparo não provavelmente envolvido no reparo de CRISPR.

Anemia de Fanconi

O caminho envolve 21 proteínas separadas e é chamado o caminho porque, se alguns dos genes para estas proteínas são danificados, os povos desenvolvem a anemia de Fanconi, uma doença hereditária rara mas séria da anemia de Fanconi em que a medula não pode fazer bastante glóbulos novos. É associado com os defeitos congénitos e um risco elevado de cancro, incluindo uma possibilidade de 10 por cento da leucemia tornando-se na infância. Poucos pacientes vivem além de 30 anos de idade.

O caminho foi sabido e estudado por décadas, mas compreendeu-se pela maior parte para reparar um tipo específico de dano do ADN: Ligações transversais do interstrand do ADN, onde um nucleotide em uma costa do ADN se liga firmemente com um nucleotide na costa adjacente, interferência com a réplica do ADN e frequentemente matança da pilha. Os pesquisadores nos anos 80 tinham relatado uma conexão entre o reparo homologia-dirigido e o caminho da anemia de Fanconi, mas tinha sido ignorado ou entendido mal, milho notável.

“Baseou em nosso trabalho, nós acreditam que o caminho da anemia de Fanconi joga um maior protagonismo em fixar outros tipos de lesões também, mas é melhor compreendido como o caminho que a dobro-costa dos reparos quebra,” Richardson disse. “Após Cas9 que edita, o caminho da anemia de Fanconi é exigido se você quer introduzir o ADN novo.”

A importância do caminho da anemia de Fanconi em reparar CRISPR quebra lances na dúvida alguns tratamentos de planeamento para a doença próprios de CRISPR, contudo. Sem um caminho activo da anemia de Fanconi, as pilhas não podem poder substituir seus genes transformados com os genes normais depois que Cas9 faz um corte.

De facto, o nível de actividade do caminho da anemia de Fanconi pode afectar como eficientemente CRISPR pode introduzir o ADN em uma pilha específica. Os pesquisadores concluíram que, quando fim-se juntar for o mecanismo do reparo da opção depois que uma ruptura da dobro-costa, o caminho da anemia de Fanconi compete com ela, e que uma actividade mais alta conduz ao reparo homologia-mais dirigido e menos à fim-junta.

Tratamentos contra o cancro

Quando os resultados ajudarem cientistas melhor a compreender os mecanismos do reparo do ADN em pilhas humanas, poderiam igualmente ajudar os pesquisadores que desenvolvem as terapias anticancerosas que visam o reparo do ADN nas células cancerosas. Porque outros factores parecem agora ser envolvidos no reparo de rupturas da dobro-costa, esta pesquisa expande a lista de proteínas que poderiam ser misregulated a fim parafusar acima o reparo do ADN nas células cancerosas e as fazer mais suscetíveis à morte.

Richardson igualmente encontrou essa das 21 proteínas no caminho, FANCD2, dirige sempre dentro no local da ruptura da dobro-costa criada por CRISPR-Cas9, indicando que joga um papel importante em regular a inserção do ADN novo no genoma no local do corte. FANCD2 poderia ser tweaked para impulsionar a freqüência com que uma pilha introduz o ADN através do reparo homologia-dirigido.

“Também, desde que FANCD2 localiza ao local das rupturas Cas9, você pode usar FANCD2 para traçar onde Cas9 está cortando em qualquer tipo da pilha,” Richardson disse. “Se você edita uma população das pilhas e você quer saber em onde em e os cortes do fora-alvo estão, você pode apenas traçar onde FANCD2 foi encontrado no genoma e você pode encontrar os cortes.”

“O caminho inteiro da anemia de Fanconi afecta o balanço entre a fim-junta e o reparo homologia-dirigido; actua como uma bobina de tráfego,” Milho disse. “Assim o genótipo de um paciente afectará como você faz a edição do gene.”

Source: http://news.berkeley.edu/2018/07/30/dna-repair-after-crispr-cutting-not-at-all-what-people-thought/