Los científicos encuentran las suposiciones de la gente sobre la reparación de la DNA después de CRISPR que corrigen para ser incorrectos

A pesar de granes esperanzas y la alta inversión en el gen CRISPR-Cas9 que corrige, los científicos todavía tienen mucho aprender sobre cómo trabaja en seres humanos.

En el último ejemplo, la Universidad de California, Berkeley, científicos encontró que las suposiciones de la gente sobre cómo las células reparan el genoma después de que la DNA de los recortes de la enzima Cas9 sea incorrecta.

El descubrimiento da discernimiento en porqué el gen CRISPR-Cas9 que corregía trabajos en casi cada célula tentativa notable bien, aunque no con éxito igual en todas las células. Y podría ayudar a investigadores a reforzar la eficiencia con la cual las células insertan la nueva DNA en el genoma - reemplazar una mutación dañina por la serie correcta de la DNA, por ejemplo - y generalmente el pellizco CRISPR-Cas9 que corrige para conseguir el resultado deseado.

“Si usted quiere tratar anemia de la célula falciforme, sus oportunidades de éxito se atan inextricablemente a la eficiencia por la cual usted puede reemplazar el gen transformado de la célula falciforme con el correcto,” dijeron al becario postdoctoral Chris Richardson, primer autor de Uc Berkeley de un papel que describe las conclusión. “Si usted cosecha millón de células de un paciente y usted tiene régimen de la inserción del 10 por ciento, ése no es pues bueno como si usted tenga 30 a 40 por ciento. El poder manipular esas células para aumentar la frecuencia de este proceso, llamada reparación homología-dirigida, es emocionante.”

El “corregir del gen es ultrapotente, con mucha promesa, pero, hasta ahora, mucho ensayo y error. La manera que trabaja en células humanas ha sido una caja negra con muchas suposiciones,” dijo el maíz de Jacob del autor importante, un profesor del adjunto de Uc Berkeley de molecular y la biología celular. “Finalmente estamos comenzando a conseguir un retrato de qué está continuando.”

El maíz, Richardson y sus colegas ahora publicarán sus conclusión en la aplicación de agosto la genética de la naturaleza del gorrón, accesible en línea.

El maíz era hasta hace poco tiempo el director científico de la biomedecina en el instituto innovador de la genómica, de un programa de investigación de la junta CRISPR entre Uc Berkeley y de Uc San Francisco. Esta caída, él ensamblará la facultad de ETH en Zurich, Suiza.

CRISPR confía en la reparación de la DNA

CRISPR-Cas9 es revolucionario debido a la precisión con la cual se dirige hacia adentro en una serie específica de la DNA fuera de mil millones en el genoma e hiende la molécula doble-trenzada de la DNA. Pero después de ése, está hasta la célula para reparar el daño.

La reparación puede suceso de dos maneras. Las enzimas pueden coser los extremos que cuelgan detrás junto, que da lugar a menudo a una o más bases - los bloques huecos de la DNA - que son agregadas o suprimidas, rompiendo la función del gen. Alternativamente, otras enzimas pueden remendar el interruptor con un único cabo de la DNA que iguala la serie de la DNA aguas arriba y río abajo desde el corte. Un cabo complementario de la DNA se crea para terminar la reparación del doble-cabo.

El anterior, llamado el fin-ensamblar no-homólogo, aparece ser el resultado más común después del corte de CRISPR. Este último, reparación homología-dirigida, suceso más con frecuencia en algunos tipos de células que otras, y requiere la presencia de un pedazo de DNA que se pueda utilizar para remendar el interruptor. Los investigadores suministran un pedazo de una sola fila de DNA y esperan a menudo que la célula lo utiliza para reemplazar la serie defectuosa por el nuevo.

Ambos procesos son una broca misteriosa, sin embargo, y nadie sabe porqué remiendo de algunas células fácilmente en la DNA mientras que lo hacen otros tan infrecuentemente.

“El entusiasmo para usar CRISPR-Cas9 para los usos médicos o sintetizados de la biología es grande, pero nadie conoce realmente qué suceso después de que usted lo ponga en las células,” Richardson dijo. “Va y crea estos interruptores y usted cuenta en las células para repararlas. Pero la gente no entiende realmente cómo ese los trabajos de proceso.”

Para descubrir que las enzimas de la reparación de la DNA son críticas a la reparación homología-dirigida después del corte de CRISPR, Richardson y el maíz empleó una técnica llamada la interferencia de CRISPR (CRISPRi) para eliminar, uno a la vez, más de 2.000 genes sabidos o sospechados para estar implicado en la reparación de la DNA, una función crítica a una célula sana.

Asombrosamente, muchos de los genes que demostraron ser importantes - reparación homología-dirigida cayeron dramáticamente cuando fueron impuestas silencio - estuvieron implicados en un sistema importante de la reparación no probablemente implicado en la reparación de CRISPR.

Anemia de Fanconi

El camino implica 21 proteínas separadas y se llama el camino porque, si los genes uces de los para estas proteínas se dañan, la gente desarrolla la anemia de Fanconi, una enfermedad hereditaria rara pero seria de la anemia de Fanconi en la cual la médula no pueda hacer a suficiente nuevos glóbulos. Se asocia a defectos de nacimiento y a un de alto riesgo del cáncer, incluyendo una ocasión del 10 por ciento de la leucemia que se convierte en niñez. Pocos pacientes viven más allá de 30 años de edad.

El camino se ha sabido y se ha estudiado por décadas, pero era entendido en gran parte para reparar una clase específica de daño de la DNA: Reticulaciones del interstrand de la DNA, donde un nucleótido en un cabo de DNA pega apretado con un nucleótido en el cabo adyacente, interferencia con la réplica de la DNA y a menudo matar a la célula. Los investigadores en los años 80 habían denunciado una conexión entre la reparación homología-dirigida y el camino de la anemia de Fanconi, pero había sido ignorado o entendido mal, maíz conocido.

“Basó en nuestro trabajo, nosotros creen que el camino de la anemia de Fanconi desempeña un papel principal en reparar otros tipos de lesiones también, pero son mejor entendido como el camino que el doble-cabo de las reparaciones se rompe,” Richardson dijo. “Después de Cas9 que corrige, se requiere el camino de la anemia de Fanconi si usted quiere insertar la nueva DNA.”

La importancia del camino de la anemia de Fanconi en reparar CRISPR rompe tiros en duda algunos tratamientos previstos para la enfermedad sí mismo de CRISPR, sin embargo. Sin un camino activo de la anemia de Fanconi, las células pueden no poder reemplazar sus genes transformados por los genes normales después de que Cas9 haga un corte.

De hecho, el nivel de actividad del camino de la anemia de Fanconi puede afectar a cómo CRISPR puede insertar eficientemente la DNA en una célula específica. Los investigadores concluyeron que, mientras que el fin-ensamblar es el mecanismo de la reparación de la omisión después de que un interruptor del doble-cabo, el camino de la anemia de Fanconi compita con él, y que una actividad más alta da lugar a la reparación homología-dirigida y menos a fin-ensamblar.

Tratamientos contra el cáncer

Mientras que las conclusión ayudan a científicos mejor a entender los mecanismos de la reparación de la DNA en células humanas, podrían también ayudar a los investigadores que desarrollaban las terapias anticáncer que apuntan la reparación de la DNA en células cancerosas. Porque otros factores ahora aparecen estar implicados en la reparación de los interruptores del doble-cabo, esta investigación despliega el filete de las proteínas que se podrían misregulated para estropear la reparación de la DNA en células cancerosas y hacerlas más susceptibles a la muerte.

Richardson también encontró aquélla de las 21 proteínas en el camino, FANCD2, se dirige siempre hacia adentro en el sitio del interruptor del doble-cabo creado por CRISPR-Cas9, indicando que desempeña un papel importante en la regulación de la inserción de la nueva DNA en el genoma en el sitio del corte. FANCD2 se podría pellizcar para reforzar la frecuencia con la cual una célula inserta la DNA vía la reparación homología-dirigida.

“También, puesto que FANCD2 localiza al sitio de los interruptores Cas9, usted puede utilizar FANCD2 para correlacionar donde Cas9 está cortando en cualquier tipo de la célula,” a Richardson dijo. “Si usted corrige una población de células y usted quiere saber en donde y están los cortes del lejos-objetivo, usted puede apenas correlacionar donde FANCD2 fue encontrado en el genoma y usted puede encontrar los cortes.”

“El camino entero de la anemia de Fanconi afecta al equilibrio entre fin-ensamblar y la reparación homología-dirigida; actúa como un poli de tráfico,” Corn dijo. “El genotipo de un paciente afectará tan a cómo usted hace corregir del gen.”

Fuente: http://news.berkeley.edu/2018/07/30/dna-repair-after-crispr-cutting-not-at-all-what-people-thought/