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Protéines d'épuration de la culture cellulaire mammifère

insights from industryDennis Karthaus, MScTeam Leader Cell CultivationIBA LifesciencesAn interview with Dennis Karthaus and Sarah Ludwig conducted by James Ives

Des protéines recombinées peuvent être produites utilisant beaucoup de types des cellules comprenant, de la levure, des bactéries, de l'insecte et de cellules mammifères. Quels avantages y a-t-il à produire les protéines recombinées employant les cellules mammifères au-dessus d'autres ?

Dans de nombreux cas les cellules mammifères sont la seule option pour produire les protéines recombinées avec les modifications goujon-de translation correctes, par exemple glycosylation, qui sont exigées pour le fonctionnement correcte de la protéine thérapeutique.

Vshivkova | Shutterstock

Manque d'Escherichia coli la capacité de plier les protéines mammifères complexes et d'exécuter des modifications goujon-de translation correctes. De plus, les modifications goujon-de translation de la levure et des cellules d'insecte diffèrent des cellules mammifères. Par conséquent, ces organismes d'hôte sont souvent une option suboptimale pour la production des protéines mammifères, particulièrement si la glycosylation est complexe ou le sialyation est exigé.

En outre, la capacité des cellules mammifères de sécréter des protéines dans le support simplifie le procédé en aval. Contrairement aux bactéries, les cellules mammifères peuvent produire de grandes protéines de plus de 50 kDa efficacement. Les systèmes bactériens forment souvent des fuselages d'inclusion si de plus grandes protéines sont exprimées. De plus, aucune endotoxine n'est introduite dans l'échantillon de protéine par la procédure d'expression.

Quelles sont les applications principales des protéines recombinées produites en cellules mammifères ?

Beaucoup de protéines recombinées produites en cellules mammifères sont appliquées pour le traitement du cancer. Particulièrement les anticorps et l'anticorps aiment les molécules, qui sont le plus souvent les protéines produites.

Les protéines de membrane sont également très importantes parce qu'elles sont utilisées généralement pour étudier les effets des médicaments potentiels et de leur mode de fonctionnement.

Ce qui sont les défis en produisant les protéines recombinées hautement pures pour la R&D

Je pense que le défi majeur est la purification simultanée de différentes protéines en peu de temps avec une méthode normale. Supplémentaire, cette méthode ne devrait avoir besoin d'aucune optimisation de la stratégie de purification pour différentes protéines et fournir de grandes pureté de plus de 90%. Le système de purification doit être coût efficace, compatible avec on des systèmes d'expression d'hôte et devrait fournir une souplesse élevée concernant la composition de tampon.

La plupart des compagnies ou instituts qui doivent exprimer beaucoup de différentes protéines, par exemple pendant la phase d'examen critique des candidats neufs de médicament, relèvent les mêmes défis chaque jour. Il vaut de mentionner que beaucoup de ces protéines sont exprimées aux concentrations faibles, particulièrement des protéines de membrane, rendant leur purification très provocante.

Puisque différentes quantités de protéine sont exigées pour différentes applications, les méthodes de purification doivent être facilement évolutives et devraient fournir une capacité suffisante de purification de protéine.

Quelle est la méthode normale actuelle pour expliquer et épurer ces protéines dans votre laboratoire ? Quels sont les avantages et les limitations de cette méthode ?

Avant la méthode de laboratoire® de dynamique de Sartoclear, nous avons employé la centrifugation pour l'éclaircissement. D'abord, nous avons granulé les cellules pendant 10 mn à 300 G. Alors nous avons ajouté une deuxième opération de centrifugation à 3.000 à 10.000 g pour enlever des saletés de cellules et pour préparer l'échantillon pour la purification® de chromatographie d'affinité de la grande capacité Streptocoque-TactinXT.

L'inconvénient majeur de cette méthode est le moment nécessaire pour les deux opérations de centrifugation. Équilibrant les tubes, le démontage du surnageant, le moment pour nettoyer les tubes de centrifugation et le temps de centrifugation lui-même peuvent reprendre à 44 mn.

Un autre goulot d'étranglement de la méthode actuelle est le fait que la centrifugeuse doit être procurable pour l'éclaircissement et puisque d'autres groupes dans le laboratoire utilisent la même machine, ceci n'est pas toujours le cas.

En conclusion, le procédé de centrifugation n'est pas très flexible en ce qui concerne le volume témoin. Nos tubes de centrifugation doivent être remplis jusqu'au moins à 80% du volume de tube pour des vitesses plus élevées de centrifugation. Par conséquent, des échantillons en-dessous de 800 ml doivent être distribués à plusieurs plus petits tubes qui a besoin d'un temps plus à commande manuelle.

Récent vous avez évalué une méthode neuve d'éclaircissement de cellules et est-ce que filtration de Sartorius, comment ceci diffère des techniques précédentes ?

La technique de filtration® de laboratoire de dynamique de Sartoclear a amélioré notre procédé d'éclaircissement remarquablement. Au total nous pouvions ramener le moment nécessaire pour l'éclaircissement de 44 mn vers le bas à 12. De plus, parce que tous les produits de laboratoire® de dynamique de Sartoclear sont à usage unique stérile, le risque de contamination croisée a été éliminé, et le filtrat était stérile.

Un autre aspect est la simplification du procédé entier. Puisque nous ne devons compter sur une grande centrifugeuse plus nous pouvons conduire l'éclaircissement immédiatement dans notre laboratoire de culture cellulaire.

En conclusion, vers le haut de et downscaling de la méthode est tout à fait tout facile qu'il est seulement nécessaire de régler le montant de l'aide de filtration.

Comment est-ce que la qualité des produits, la puissance de protéine et le régime de totalisation d'IgG ont été affectés à l'aide de la méthode d'éclaircissement et de filtration de Sartoclear si comparés à la centrifugation ? Comment est-ce que ceci a été vérifié ?

Naturellement, chaque fois que vous changez une méthode vous devez s'assurer que la qualité de votre produit demeure inchangée. Pour nous comme OIN 9001 ont certifié la compagnie que c'est absolument obligatoire. Pour vérifier l'influence du procédé d'éclaircissement® de laboratoire de dynamique de Sartoclear sur la qualité des produits, nous avons expliqué une culture de MEXi-293E (HEK293) exprimant un anticorps monoclonal protégé par fusible à une Jumeau-Streptocoque-balise®, utilisant notre procédé normal de centrifugation en parallèle à la méthode de laboratoire® de dynamique de Sartoclear.

Après l'éclaircissement nous a purifié l'anticorps des différents échantillons expliqués par l'intermédiaire de la purification® d'écoulement par gravité de la grande capacité Streptocoque-TactinXT. L'éluat s'est analysé par SDS-PAGE, tache occidentale, mesure photométrique à 280 nanomètre et chromatographie d'exclusion de taille.

Le SDS-PAGE et l'analyse occidentale de tache ont indiqué qu'il n'y avait aucune différence dans la pureté de protéine entre les deux méthodes d'éclaircissement et que la pureté 100% a été réalisée avec la purification® de la grande capacité Streptocoque-TactinXT.

L'utilisation du laboratoire de dynamique® de Sartoclear n'a pas influencé la totalisation de l'anticorps, parce que le rapport de l'anticorps totalisé, déterminé par la chromatographie d'exclusion de taille, était la même que pour l'échantillon centrifugé.

En conclusion, nous avons constaté que la puissance de protéine était la même pour les deux méthodes qui prouvé qu'aucun anticorps n'a été lié aux composantes du système de laboratoire® de dynamique de Sartoclear.

En résumé, l'utilisation de la méthode de laboratoire® de dynamique de Sartoclear n'a exercé aucun effet négatif sur la qualité ou la quantité de protéine.

Dans votre recherche, des anticorps ont été marqués avec la Jumeau-Streptocoque-balise® pour l'opération de purification. Pourquoi employez-vous ce système de balise d'affinité pour votre purification ?

Le système de Streptocoque-balise permet la purification des protéines dans des conditions physiologiques et de dénaturant avec des puretés dépassant habituellement 90%. Comparé à tous autres systèmes d'affinité la Jumeau-Streptocoque-balise® en combination avec Streptocoque-TactinXT® atteint l'affinité obligatoire la plus élevée dans des gammes de P.M., alors que le système met à jour toujours sa réversibilité. C'est avantageux particulièrement pour les échantillons concentrés inférieurs en grands volumes.

En raison de la petite taille du Streptocoque-tagII® (8aa) et de la Jumeau-Streptocoque-balise® (28aa) il n'y a aucun besoin de retirer la balise.

De plus, le système est compatible avec une grande variété de réactifs comme des détergents, des concentrations élevées en sel, des agents réducteurs, des chélateurs, etc.

Ces propriétés combinées avec le fait que le système convient pour la purification de protéine de bactérien, la levure, l'insecte et les hôtes mammifères effectuent à ce système le système supérieur de balise.

Il est facile à utiliser sans besoin d'optimisation comme par exemple régler la concentration en imidazol à l'élution en employant le système de Son-balise. Ceci effectue au système de Streptocoque-balise la solution parfaite pour les défis de purification de protéine que j'ai cités précédemment.

Dans votre recherche, les échantillons qui ont été centrifugés n'étaient pas stériles qui pourrait être important pour beaucoup d'applications et exigerait une opération stérile indépendante de filtration. Comment est-ce que ceci aurait été réalisé et comment est-ce que ceci aurait affecté la procédure utilisée ?

Nous avons filtré l'échantillon avec des 0,2 filtres de haut de bouteille de µm si la stérilité est exigée. Naturellement, ceci mène à l'heure de processus complémentaire pour l'éclaircissement et les frais supplémentaires.

L'avantage du système de laboratoire® de dynamique de Sartoclear est que cette opération de filtration est déjà comprise dans le procédé d'éclaircissement.

Par conséquent, si la stérilité est exigée, nous ne devons pas ajouter cette opération séparé.  Ceci augmente le temps où nous épargnons à l'aide du système de laboratoire® de dynamique de Sartoclear comparé à notre méthode normale.

Quelles limitations y a-t-il pour la méthode de Sartoclear d'éclaircissement et de filtration de cellules mammifères ?

Dans des nos mains, nous ne voyons pas une limitation sur cette méthode. Les usagers devraient vérifier la guérison totale de leur protéine recombinée après éclaircissement avant d'employer cette méthode régulièrement, pour être du côté sûr.

Les protéines recombinées ont le sort de potentiel dans un large éventail d'applications. Quels avancements espérez-vous voir pour augmenter leur évolutivité et utilisation répandue en ce qui concerne vos applications de R&D ?

La production des protéines recombinées est toujours une production dans un système de boîte noire. En effet, nous nous sommes renseignés beaucoup sur la façon dont les cellules expriment des protéines et lequel les facteurs peuvent influencer la quantité et la qualité de protéine.

Cependant, beaucoup d'aspects de la façon dont les protéines de processus de cellules sont encore peu claires. Je pense que les améliorations de l'analyse de structure, de l'utilisation de CRISPR/Cas et des avancements grands dans le domaine de l'analyse et de l'exploitation de données de caractéristiques combinées avec l'automatisation élevée de débit mèneront à la connaissance plus complète de ces procédés intracellulaires. Ceci en échange mènera aux procédés de production profilés de protéine.

La tendance de diminuer l'écaille d'expression et d'augmenter le débit des protéines dans une phase tôt de recherche et développement piloteront le besoin de systèmes de purification et les formats qui supportent des procédés de ce débit de haut.

Où peuvent les lecteurs trouver plus d'informations ?

Plus d'information peut être trouvée à IBA Lifesciences, Sartorius.

Au sujet de Dennis Karthaus, GCS

Dennis Karthaus a reçu son degré principal du ` s en biotechnologie de l'université des sciences appliquées dans Bremerhaven. Pendant sa thèse au service de la biotechnologie pharmaceutique à l'institut de Fraunhofer pour la toxicologie et la médecine expérimentale il a travaillé au développement des plates-formes de purification de protéine et dans le développement de lignée cellulaire.

En 2012, Dennis Karthaus a joint IBA Lifesciences. Il est responsable du service fait sur commande mammifère d'expression de la protéine et de purification et du développement de produits dans ce domaine.

Citations

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