Attenzione: questa pagina è una traduzione automatica di questa pagina originariamente in lingua inglese. Si prega di notare in quanto le traduzioni sono generate da macchine, non tutte le traduzioni saranno perfetti. Questo sito web e le sue pagine web sono destinati ad essere letto in inglese. Ogni traduzione del sito e le sue pagine web possono essere imprecise e inesatte, in tutto o in parte. Questa traduzione è fornita per comodità.

Proteine di depurazione da coltura cellulare mammifera

insights from industryDennis Karthaus, MScTeam Leader Cell CultivationIBA LifesciencesAn interview with Dennis Karthaus and Sarah Ludwig conducted by James Ives

Le proteine recombinanti possono essere prodotte facendo uso di molti tipi di celle compreso, di lievito, di batteri, di insetto e di cellule di mammiferi. Che vantaggi sono ci a produrre le proteine recombinanti usando le cellule di mammiferi sopra altre?

In molti casi le cellule di mammiferi sono la sola opzione per produrre le proteine recombinanti con le modifiche post-di traduzione corrette, per esempio glicosilazione, che sono richieste per la funzione adeguata della proteina terapeutica.

Vshivkova | Shutterstock

Mancanza di Escherichia coli la capacità di profilatura le proteine mammifere complesse e di realizzare le modifiche post-di traduzione corrette. Inoltre, le modifiche post-di traduzione di lievito e delle celle dell'insetto differiscono dalle cellule di mammiferi. Di conseguenza, questi organismi ospite sono spesso un'opzione suboptimale per la produzione delle proteine mammifere, particolarmente se la glicosilazione è complessa o il sialyation è richiesto.

Ancora, la capacità delle cellule di mammiferi di secernere le proteine nel media semplifica il trattamento a valle. Contrariamente ai batteri, le cellule di mammiferi possono produrre efficientemente le grandi proteine più di del kDa 50. I sistemi batterici formano spesso le inclusioni se le più grandi proteine sono espresse. Inoltre, nessun'endotossina è presentata nel campione della proteina dalla procedura di espressione.

Che cosa sono le applicazioni principali delle proteine recombinanti prodotte in cellule di mammiferi?

Molte proteine recombinanti prodotte in cellule di mammiferi sono applicate per la terapia del cancro. Particolarmente gli anticorpi e l'anticorpo gradiscono le molecole, che sono il più delle volte le proteine prodotte.

Le proteine della membrana sono egualmente molto importanti perché sono comunemente usate studiare gli effetti delle droghe potenziali e del loro modo di funzionamento.

Che cosa sono le sfide nella produzione delle proteine recombinanti altamente pure per gli scopi di R & S

Penso che la sfida principale sia la depurazione simultanea delle proteine differenti in poco tempo con un metodo standard. Ulteriormente, questo metodo dovrebbe non avere bisogno dell'ottimizzazione della strategia di depurazione per le proteine differenti e fornire le elevate purezze di più di 90%. Il sistema di depurazione deve essere costato efficiente, compatibile con molti sistemi di espressione ospite e dovrebbe fornire un'alta flessibilità per quanto riguarda la composizione nel buffer.

La maggior parte di società o dei istituti che devono esprimere molte proteine differenti, per esempio durante la fase della selezione di nuovi candidati della droga, sta affrontando le stesse sfide ogni giorno. Vale la pena di citare che molte queste proteine sono espresse ai bassi livelli, particolarmente proteine della membrana, rendenti la loro depurazione molto provocatoria.

Poiché gli importi differenti di proteina sono richiesti per le applicazioni differenti, i metodi di depurazione devono essere facilmente evolutivi e dovrebbero fornire una capacità sufficiente di depurazione della proteina.

Che cosa è il metodo standard corrente per chiarire e depurare queste proteine nel vostro laboratorio? Che cosa sono i vantaggi e le limitazioni di questo metodo?

Prima del metodo del laboratorio® di dinamica di Sartoclear, abbiamo usato la centrifugazione per il chiarimento. In primo luogo, abbiamo appallottolato le celle per 10 minuti a 300 G. Poi abbiamo aggiunto un secondo punto di centrifugazione a 3.000 a 10.000 g per eliminare i detriti delle cellule e per preparare il campione per la depurazione® della cromatografia di affinità di capacità elevata Streptococco-TactinXT.

Lo svantaggio principale di questo metodo è il momento necessario per i due punti di centrifugazione. Saldando i tubi, la rimozione del galleggiante, il momento per la pulizia dei tubi di centrifugazione ed il tempo stesso di centrifugazione possono prendere a 44 minuti.

Un altro grave ostacolo del metodo corrente è il fatto che la centrifuga deve essere disponibile per chiarimento e poiché altri gruppi in laboratorio stanno utilizzando lo stesso commputer, questo non è sempre il caso.

Per concludere, il trattamento di centrifugazione non è molto flessibile riguardo al volume di campione. I nostri tubi di centrifugazione devono essere riempiti fino ad un massimo di almeno 80% del volume del tubo per le più alte velocità di centrifugazione. Di conseguenza, i campioni inferiore a 800 ml devono distribuirsi a parecchi più piccoli tubi che richiede il tempo più pratico.

Recentemente avete valutato un nuovo metodo di chiarimento delle cellule e filtrazione dal Sartorius, come questo differisce dalle tecniche precedenti?

La tecnica di filtrazione® del laboratorio di dinamica di Sartoclear ha migliorato notevolmente il nostro trattamento di chiarimento. Nel totale potevamo ridurre il momento necessario per chiarimento a partire da 44 minuti giù a 12. Inoltre, perché tutti i prodotti del laboratorio® di dinamica di Sartoclear sono monouso sterile, il rischio di contaminazione trasversale si è eliminato ed il filtrato era sterile.

Un altro aspetto è la semplificazione del trattamento di tutto. Poiché non dobbiamo contare su una grande centrifuga più possiamo condurre il chiarimento subito nel nostro laboratorio della coltura cellulare.

Per concludere, su e downscaling del metodo è abbastanza per quanto sia necessario facile soltanto da regolare l'importo l'aiuto di filtrazione.

Come la qualità del prodotto, il rendimento della proteina e la tariffa dell'aggregazione di IgG sono stati influenzati usando il metodo di chiarimento e di filtrazione di Sartoclear una volta confrontati a centrifugazione? Come questo è stato provato?

Naturalmente, ogni volta che cambiate un metodo dovete assicurarti che la qualità del vostro prodotto rimanga inalterata. Per noi come iso 9001 hanno certificato la società che questo è assolutamente obbligatorio. Per verificare l'influenza del trattamento di chiarimento® del laboratorio di dinamica di Sartoclear sulla qualità del prodotto, abbiamo chiarito una cultura di MEXi-293E (HEK293) che esprime un anticorpo monoclonale fuso ad un Gemello-Streptococco-tag®, facendo uso del nostro trattamento standard di centrifugazione parallelamente al metodo del laboratorio® di dinamica di Sartoclear.

Dopo che il chiarimento noi ha depurato l'anticorpo dai campioni chiariti differenti via depurazione® di flusso per gravità di capacità elevata Streptococco-TactinXT. L'eluito è stato analizzato da SDS-PAGE, dalla macchia occidentale, dalla misura fotometrica a 280 nanometro e dalla cromatografia di esclusione di dimensione.

Lo SDS-PAGE e l'analisi occidentale della macchia hanno rivelato che non c'era differenza nella purezza della proteina fra i due metodi di chiarimento e che la purezza 100% è stata raggiunta con depurazione® di capacità elevata Streptococco-TactinXT.

L'uso del laboratorio di dinamica® di Sartoclear non ha influenzato l'aggregazione dell'anticorpo, perché il rapporto dell'anticorpo cumulato, determinato mediante la cromatografia di esclusione di dimensione, era lo stesso di per il campione centrifugato.

Per concludere, abbiamo trovato che il rendimento della proteina era lo stesso per entrambi i metodi che hanno provato che nessun anticorpo è stato limitato alle componenti del sistema di laboratorio® di dinamica di Sartoclear.

Riassumendo, l'uso del metodo del laboratorio® di dinamica di Sartoclear non ha avuto effetto negativo sulla qualità o sulla quantità della proteina.

Nella vostra ricerca, gli anticorpi sono stati contrassegnati con il Gemello-Streptococco-tag® per il punto di depurazione. Perché usate questo sistema del tag di affinità per la vostra depurazione?

Il sistema del Streptococco-tag permette la depurazione delle proteine nei termini fisiologici e denaturanti con le purezze che superano solitamente 90%. Confrontato a tutti i altri sistemi di affinità il Gemello-Streptococco-tag® congiuntamente a Streptococco-TactinXT® raggiunge il più alta affinità obbligatoria negli intervalli di pM, mentre il sistema ancora mantiene la sua reversibilità. Ciò è vantaggiosa specificamente per i campioni concentrati minimo nei grandi volumi.

dovuto il di piccola dimensione dello Streptococco-tagII® (8aa) e del Gemello-Streptococco-tag® (28aa) non c'è necessità di eliminare il tag.

Inoltre, il sistema è compatibile con una grande varietà di reagenti come i detersivi, le alte concentrazioni nel sale, gli agenti riduttori, i chelatori, ecc.

Questi beni combinati con il fatto che il sistema è adatto a depurazione della proteina da batterico, il lievito, l'insetto ed i host mammiferi rendono a questo sistema il sistema superiore del tag.

È di facile impiego senza l'esigenza dell'ottimizzazione come per esempio registrare la concentrazione nell'imidazolo per ottenere l'eluizione quando usando il sistema del Suo-tag. Ciò rende al sistema del Streptococco-tag la soluzione perfetta per le sfide che di depurazione della proteina ho citato più presto.

Nella vostra ricerca, i campioni che sono stati centrifugati non erano sterili in grado di essere importante per molte applicazioni ed avrebbe richiesto un punto sterile separato di filtrazione. Come questo sarebbe stato raggiunto e come questo avrebbe pregiudicato la procedura seguita?

Abbiamo filtrato il campione con i 0,2 filtri dalla cima della bottiglia del µm se la sterilità è richiesta. Naturalmente, questo piombo a tempo trattato supplementare per chiarimento e costi supplementari.

Il vantaggio del sistema di laboratorio® di dinamica di Sartoclear è che questo punto di filtrazione già è incluso nel trattamento di chiarimento.

Di conseguenza, se la sterilità è richiesta, non dobbiamo aggiungere esclusivamente questo punto.  Ciò aumenta il tempo che risparmiamo usando il sistema di laboratorio® di dinamica di Sartoclear confrontato al nostro metodo standard.

Che limitazioni sono ci per il metodo di Sartoclear di chiarimento e di filtrazione della cellula di mammiferi?

In nostre mani, non vediamo una limitazione di questo metodo. Gli utenti dovrebbero controllare per vedere se c'è il ripristino completo della loro proteina recombinante dopo chiarimento prima di usando questo metodo regolarmente, per essere dal lato sicuro.

Le proteine recombinanti hanno lotto di potenziale in una vasta gamma di applicazioni. Che avanzamenti sperate di vedere per aumentare la loro scalabilità ed uso molto diffuso riguardo alle vostre applicazioni di R & S?

La produzione delle proteine recombinanti è ancora una produzione in un sistema della scatola nera. Effettivamente, abbiamo imparato molto circa come le celle esprimono le proteine e cui i fattori possono influenzare la quantità e la qualità della proteina.

Tuttavia, molti aspetti di come le celle elaborano le proteine sono ancora poco chiari. Penso che i miglioramenti nell'analisi strutturale, nell'uso di CRISPR/Cas e nei grandi avanzamenti nel campo dell'analisi e di data mining di dati combinati con l'alta automatizzazione di capacità di lavorazione piombo a conoscenza più completa di questi trattamenti intracellulari. Ciò in cambio piombo ai processi di produzione aerodinamici della proteina.

La tendenza di fare diminuire il disgaggio di espressione e di aumento della capacità di lavorazione delle proteine in una fase in anticipo di ricerca e sviluppo determineranno l'esigenza dei sistemi di depurazione ed i formati che supportano trattamenti di questa gli alti capacità di lavorazione.

Dove possono i lettori trovare più informazioni?

Più informazioni possono essere trovate a IBA Lifesciences, Sartorius.

Circa Dennis Karthaus, MSc

Dennis Karthaus ha ricevuto la sua laurea matrice del ` s in biotecnologia dall'università di scienze applicate in Bremerhaven. Durante la sua tesi al dipartimento di biotecnologia farmaceutica all'istituto di Fraunhofer per tossicologia e medicina sperimentale ha lavorato allo sviluppo delle piattaforme di depurazione della proteina e nello sviluppo della linea cellulare.

Nel 2012, Dennis Karthaus ha unito IBA Lifesciences. È responsabile del servizio su ordinazione mammifero di espressione & di depurazione della proteina e dello sviluppo di prodotto in materia.

Citations

Please use one of the following formats to cite this article in your essay, paper or report:

  • APA

    Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG. (2018, September 18). Proteine di depurazione da coltura cellulare mammifera. News-Medical. Retrieved on July 04, 2020 from https://www.news-medical.net/news/20180918/Purifying-Proteins-from-Mammalian-Cell-Culture.aspx.

  • MLA

    Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG. "Proteine di depurazione da coltura cellulare mammifera". News-Medical. 04 July 2020. <https://www.news-medical.net/news/20180918/Purifying-Proteins-from-Mammalian-Cell-Culture.aspx>.

  • Chicago

    Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG. "Proteine di depurazione da coltura cellulare mammifera". News-Medical. https://www.news-medical.net/news/20180918/Purifying-Proteins-from-Mammalian-Cell-Culture.aspx. (accessed July 04, 2020).

  • Harvard

    Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG. 2018. Proteine di depurazione da coltura cellulare mammifera. News-Medical, viewed 04 July 2020, https://www.news-medical.net/news/20180918/Purifying-Proteins-from-Mammalian-Cell-Culture.aspx.