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Refinando proteínas da cultura celular mamífera

insights from industryDennis Karthaus, MScTeam Leader Cell CultivationIBA LifesciencesAn interview with Dennis Karthaus and Sarah Ludwig conducted by James Ives

As proteínas de recombinação podem ser produzidas usando muitos tipos de incluir das pilhas, de fermento, de bactérias, de insecto e de pilhas mamíferas. Que vantagens há a produzir proteínas de recombinação usando pilhas mamíferas sobre outro?

Em muitos casos as pilhas mamíferas são a única opção para produzir proteínas de recombinação com alterações cargo-translational correctas, por exemplo glycosylation, que são exigidas para a função apropriada da proteína terapêutica.

Vshivkova | Shutterstock

Falta de Escherichia Coli a capacidade para dobrar proteínas mamíferas complexas e para executar alterações cargo-translational correctas. Além, as alterações cargo-translational do fermento e das pilhas do insecto diferem das pilhas mamíferas. Conseqüentemente, estes organismos do anfitrião são frequentemente uma opção suboptimal para a produção de proteínas mamíferas, especialmente se o glycosylation é complexo ou o sialyation está exigido.

Além disso, a capacidade de pilhas mamíferas para segregar proteínas no media simplifica o processo a jusante. Em contraste com as bactérias, as pilhas mamíferas podem produzir grandes proteínas mais do kDa de 50 eficientemente. Os sistemas bacterianos formam frequentemente corpos de inclusão se as proteínas maiores são expressadas. Além, nenhuma endotoxina é introduzida na amostra da proteína pelo procedimento da expressão.

Que são as aplicações principais das proteínas de recombinação produzidas em pilhas mamíferas?

Muitas proteínas de recombinação produzidas em pilhas mamíferas são aplicadas para a terapia do cancro. Especialmente os anticorpos e o anticorpo gostam das moléculas, que são mais frequentemente as proteínas produzidas.

As proteínas da membrana são igualmente muito importantes porque são de uso geral estudar os efeitos de drogas potenciais e seu modo de operação.

O que são os desafios em produzir proteínas de recombinação altamente puras para finalidades do R&D

Eu penso que o desafio principal é a purificação simultânea de proteínas diferentes em um curto período de tempo com um método padrão. Adicionalmente, este método deve não precisar nenhuma optimização da estratégia da purificação para proteínas diferentes e fornecer purezas altas de mais de 90%. O sistema da purificação deve ser custado eficiente, compatível com muitos sistemas da expressão do anfitrião e deve fornecer uma flexibilidade alta em relação à composição do amortecedor.

A maioria empresas ou de institutos que devem expressar muitas proteínas diferentes, por exemplo durante a fase da selecção de candidatos novos da droga, estão enfrentando os mesmos desafios cada dia. Vale mencionando que muitas estas proteínas estão expressadas a baixos níveis, especialmente as proteínas da membrana, fazendo sua purificação muito desafiante.

Desde que as quantidades diferentes de proteína são exigidas para aplicações diferentes, os métodos da purificação devem ser facilmente evolutivos e devem fornecer uma suficiente capacidade da purificação da proteína.

Que é o método padrão actual para esclarecer e refinar estas proteínas em seu laboratório? Que são as vantagens e as limitações deste método?

Antes do método do laboratório® da dinâmica de Sartoclear, nós usamos a centrifugação para o esclarecimento. Primeiramente, nós granulamos as pilhas por 10 minutos em 300 G. Então nós adicionamos uma segunda etapa da centrifugação em 3.000 a 10.000 g para remover os restos de pilha e para preparar a amostra para a purificação® da cromatografia de afinidade da capacidade Strep-TactinXT alta.

O inconveniente principal deste método é o momento necessário para as duas etapas da centrifugação. Equilibrando as câmaras de ar, a remoção do supernatant, o momento para limpar as câmaras de ar da centrifugação e o tempo próprio da centrifugação podem tomar até 44 minutos.

Um outro gargalo do método actual é o facto de que o centrifugador deve estar disponível para o esclarecimento e desde que outros grupos no laboratório estão usando a mesma máquina, este não é sempre o caso.

Finalmente, o processo da centrifugação não é muito flexível no que diz respeito ao volume de amostra. Nossas câmaras de ar da centrifugação devem ser enchidas até pelo menos 80% do volume da câmara de ar para umas velocidades mais altas da centrifugação. Conseqüentemente, as amostras abaixo de 800 ml devem ser distribuídas a diversas câmaras de ar menores que exige um tempo mais a trabalhar.

Você tem avaliado recentemente um método novo do esclarecimento da pilha e filtragem do sartório, como este difere das técnicas precedentes?

A técnica da filtragem® do laboratório da dinâmica de Sartoclear melhorou nosso processo do esclarecimento notàvel. No total nós podíamos reduzir para baixo o momento necessário para o esclarecimento de 44 minutos a 12. Além, porque todos os produtos do laboratório® da dinâmica de Sartoclear são único uso estéril, o risco de contaminação transversal foi eliminado, e o filtrado era estéril.

Um outro aspecto é a simplificação do processo inteiro. Desde que nós não temos que confiar em um grande centrifugador anymore nós podemos conduzir o esclarecimento imediatamente em nosso laboratório da cultura celular.

Finalmente, acima de e downscaling do método é bastante por mais fácil que seja somente necessário ajustar a quantidade de auxílio da filtragem.

Como a qualidade de produto, o rendimento da proteína e a taxa da agregação de IgG foram afectados usando o método do esclarecimento e da filtragem de Sartoclear quando comparados à centrifugação? Como isto foi testado?

Naturalmente, cada vez que você muda um método você deve assegurar-se de que a qualidade de seu produto permaneça não afectada. Para nós como um ISO 9001 certificou a empresa que este é absolutamente imperativo. Para testar a influência do processo do esclarecimento® do laboratório da dinâmica de Sartoclear na qualidade de produto, nós esclarecemos uma cultura de MEXi-293E (HEK293) que expressa um anticorpo monoclonal fundido a uma Gêmeo-Strep-etiqueta®, usando nosso processo padrão da centrifugação paralelamente ao método do laboratório® da dinâmica de Sartoclear.

Depois que o esclarecimento nós refinou o anticorpo das amostras esclarecidas diferentes através da purificação® do fluxo de gravidade da capacidade Strep-TactinXT alta. O eluído foi analisado por SDS-PAGE, pela mancha ocidental, pela medida fotométrica em 280 nanômetro e pela cromatografia da exclusão do tamanho.

O SDS-PAGE e a análise ocidental da mancha revelaram que não havia nenhuma diferença na pureza da proteína entre os dois métodos do esclarecimento e que a pureza 100% estêve conseguida com purificação® da capacidade Strep-TactinXT alta.

O uso do laboratório da dinâmica® de Sartoclear não influenciou a agregação do anticorpo, porque a relação do anticorpo agregado, determinada pela cromatografia da exclusão do tamanho, era o mesmo que para a amostra centrifugada.

Finalmente, nós encontramos que o rendimento da proteína era o mesmo para ambos os métodos que mostraram que nenhum anticorpo estêve limitado aos componentes do sistema de laboratório® da dinâmica de Sartoclear.

Em resumo, o uso do método do laboratório® da dinâmica de Sartoclear não teve nenhum efeito negativo na qualidade ou na quantidade de proteína.

Em sua pesquisa, os anticorpos foram etiquetados com a Gêmeo-Strep-etiqueta® para a etapa da purificação. Por que você usa este sistema da etiqueta da afinidade para sua purificação?

O sistema da Strep-etiqueta permite a purificação das proteínas sob condições fisiológicos e desnaturando com as purezas que excedem geralmente 90%. Comparado a todos sistemas restantes da afinidade a Gêmeo-Strep-etiqueta® em combinação com o Strep-TactinXT® alcança a afinidade obrigatória a mais alta em escalas do pM, quando o sistema ainda mantiver seu reversibility. Isto é vantajoso especificamente para amostras concentradas ponto baixo em grandes volumes.

Devido ao tamanho pequeno do Strep-tagII® (8aa) e da Gêmeo-Strep-etiqueta® (28aa) não há nenhuma necessidade de remover a etiqueta.

Além, o sistema é compatível com uma grande variedade de reagentes como detergentes, concentrações altas de sal, agentes de diminuição, chelators, etc.

Estas propriedades combinadas com o facto de que o sistema é apropriado para a purificação da proteína de bacteriano, o fermento, o insecto e os anfitriões mamíferos fazem a este sistema o sistema superior da etiqueta.

É fácil de usar sem a necessidade para a optimização como por exemplo o ajuste da concentração do imidazole para a eluição ao usar o sistema da Seu-etiqueta. Isto faz ao sistema da Strep-etiqueta a solução perfeita para os desafios que da purificação da proteína eu tenho mencionado mais cedo.

Em sua pesquisa, as amostras que foram centrifugadas não eram estéreis que poderia ser importante para muitas aplicações e exigiria uma etapa estéril separada da filtragem. Como isto seria conseguido e como este afectaria o procedimento usado?

Nós filtramos a amostra com uns 0,2 filtros da parte superior da garrafa do µm se a esterilidade é exigida. Naturalmente, isto conduz ao tempo adicional do processo para o esclarecimento e aos custos adicionais.

A vantagem do sistema de laboratório® da dinâmica de Sartoclear é que esta etapa da filtragem está incluída já no processo do esclarecimento.

Conseqüentemente, se a esterilidade é exigida, nós não temos que adicionar esta etapa separada.  Isto aumenta o tempo onde nós ganhamos usando o sistema de laboratório® da dinâmica de Sartoclear comparado a nosso método padrão.

Que limitações há para o método de Sartoclear do esclarecimento e da filtragem da pilha mamífera?

Em nossas mãos, nós não vemos uma limitação neste método. Os usuários devem verificar para ver se há a recuperação completa de sua proteína de recombinação após o esclarecimento antes de usar este método regularmente, para estar no lado seguro.

As proteínas de recombinação têm o lote do potencial em uma vasta gama de aplicações. Que avanços você espera ver para aumentar seus escalabilidade e uso difundido no que diz respeito a suas aplicações do R&D?

A produção de proteínas de recombinação é ainda uma produção em um sistema da caixa negra. Certamente, nós aprendemos muito sobre como as pilhas expressam proteínas e que os factores podem influenciar a quantidade e a qualidade da proteína.

Não obstante, muitos aspectos de como as proteínas do processo das pilhas são ainda obscuras. Eu penso que as melhorias na análise de estrutura, no uso de CRISPR/Cas e nos grandes avanços no campo da mineração de análise de dados e de dados combinada com o automatismo alto da produção conduzirão a um conhecimento mais detalhado destes processos intracelulares. Isto em retorno conduzirá aos processos de produção aerodinâmicos da proteína.

A tendência de diminuir a escala da expressão e de aumentar a produção das proteínas em uma fase adiantada da investigação e desenvolvimento conduzirão a necessidade para sistemas da purificação e os formatos que apoiam processos altos desta produção.

Onde podem os leitores encontrar mais informação?

Mais informação pode ser encontrada em IBA Lifesciences, sartório.

Sobre Dennis Karthaus, CAM

Dennis Karthaus recebeu seu diploma mestre do ` s na biotecnologia da universidade de ciências aplicadas em Bremerhaven. Durante sua tese no departamento da biotecnologia farmacêutica no instituto de Fraunhofer para a toxicologia e a medicina experimental trabalhou na revelação de plataformas da purificação da proteína e na revelação da linha celular.

Em 2012, Dennis Karthaus juntou-se a IBA Lifesciences. É responsável para o serviço feito sob encomenda mamífero da expressão & da purificação da proteína e o desenvolvimento de produtos neste campo.

Citations

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