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Proteínas de la purificación del cultivo celular mamífero

insights from industryDennis Karthaus, MScTeam Leader Cell CultivationIBA LifesciencesAn interview with Dennis Karthaus and Sarah Ludwig conducted by James Ives

Las proteínas recombinantes se pueden producir usando muchos tipos de células incluyendo, de levadura, de bacterias, de insecto y de células mamíferas. ¿Qué ventajas hay a producir las proteínas recombinantes usando las células mamíferas sobre otras?

En muchos casos las células mamíferas son la única opción para producir las proteínas recombinantes con las modificaciones poste-de translación correctas, e.g glycosylation, que se requieren para la función apropiada de la proteína terapéutica.

Vshivkova | Shutterstock

Falta de Escherichia Coli la capacidad de doblar las proteínas mamíferas complejas y de realizar modificaciones poste-de translación correctas. Además, las modificaciones poste-de translación de la levadura y de las células del insecto difieren de las células mamíferas. Por lo tanto, estos organismos del ordenador principal son a menudo una opción subóptima para la producción de proteínas mamíferas, especialmente si el glycosylation es complejo o se requiere el sialyation.

Además, la capacidad de células mamíferas de secretar las proteínas en el ambiente simplifica el proceso rio abajo. En contraste con bacterias, las células mamíferas pueden producir las proteínas grandes más del kDa de 50 eficientemente. Los sistemas bacterianos forman a menudo carrocerías de partícula extraña si se expresan proteínas más grandes. Además, no se introduce ningunas endotoxinas en la muestra de la proteína por el procedimiento de la expresión.

¿Cuáles son los usos principales de las proteínas recombinantes producidas en células mamíferas?

Muchas proteínas recombinantes producidas en células mamíferas son aplicadas para la terapia del cáncer. Especialmente los anticuerpos y el anticuerpo tienen gusto de las moléculas, que son lo más frecuentemente las proteínas producidas.

Las proteínas de la membrana son también muy importantes porque son de uso general estudiar los efectos de drogas potenciales y de su modo de operación.

Cuáles son los retos en producir las proteínas recombinantes altamente puras para los propósitos del R&D

Pienso que el reto mayor es la purificación simultánea de diversas proteínas en poco tiempo con un método estándar. Además, este método no debe necesitar ninguna optimización de la estrategia de la purificación para diversas proteínas y ofrecer purezas elevadas de más el de 90%. El sistema de la purificación se debe costar eficiente, compatible con muchos los sistemas de la expresión del ordenador principal y debe ofrecer una alta adaptabilidad con respecto a la composición del almacenador intermedio.

La mayoría de las compañías o de los institutos que deben expresar muchas diversas proteínas, e.g durante la fase de la investigación de los nuevos candidatos de la droga, están haciendo frente a los mismos retos cada día. Vale el mencionar de que muchas estas proteínas están expresadas en los niveles bajos, especialmente las proteínas de la membrana, haciendo su purificación muy desafiadora.

Puesto que diversas cantidades de proteína se requieren para diversos usos, los métodos de la purificación deben ser fácilmente escalables y deben ofrecer una suficiente capacidad de la purificación de la proteína.

¿Cuál es el método estándar actual para clarificar y para purificar estas proteínas en su laboratorio? ¿Cuáles son las ventajas y las limitaciones de este método?

Antes del método del laboratorio® de la dinámica de Sartoclear, utilizamos la centrifugación para la clarificación. Primero, granulamos las células por 10 minutos en 300 G. Entonces agregamos un segundo paso de la centrifugación en 3.000 a 10.000 g para quitar los escombros de célula y para preparar la muestra para la purificación® de la cromatografía de afinidad de la alta capacidad Strep-TactinXT.

La desventaja mayor de este método es la época necesaria para los dos pasos de la centrifugación. Equilibrando los tubos, el retiro del sobrenadante, la época para limpiar los tubos de la centrifugación y el tiempo sí mismo de la centrifugación pueden tomar hasta 44 minutos.

Otro atascamiento del método actual es el hecho de que la centrifugadora debe estar disponible para la clarificación y puesto que otros grupos en el laboratorio están utilizando la misma máquina, éste no es siempre el caso.

Finalmente, el proceso de la centrifugación no es muy flexible en cuanto al volumen de muestra. Nuestros tubos de la centrifugación se deben llenar hasta por lo menos el 80% del volumen del tubo para velocidades más altas de la centrifugación. Por lo tanto, las muestras abajo de 800 ml se deben distribuir a varios tubos más pequeños que requiere un tiempo más con manos.

¿Usted ha evaluado recientemente un nuevo método de clarificación de la célula y filtración del sartorio, cómo éste difiere de técnicas anteriores?

La técnica de la filtración® del laboratorio de la dinámica de Sartoclear perfeccionó nuestro proceso de la clarificación notable. En total podíamos reducir la época necesaria para la clarificación a partir de 44 minutos hacia abajo a 12. Además, porque todos los productos del laboratorio® de la dinámica de Sartoclear son no reutilizables estéril, el riesgo de contaminación cruzada fue eliminado, y el líquido filtrado era estéril.

Clarification and Sterile Filtration of Mammalian Cell Culture with Sartoclear Dynamics® Lab P15

Otro aspecto es la simplificación del proceso entero. Puesto que no tenemos que confiar en una centrifugadora grande más podemos conducto la clarificación inmediatamente en nuestro laboratorio del cultivo celular.

Finalmente, encima de y el downscaling del método es muy tan fácil que es solamente necesario ajustar a la cantidad de socorro de la filtración.

¿Cómo la calidad del producto, el rendimiento de la proteína y el régimen de la agregación de IgG fueron afectados usando el método de la clarificación y de la filtración de Sartoclear cuando estaba comparada a la centrifugación? ¿Cómo esto fue probada?

Por supuesto, cada vez que usted cambia un método usted debe asegurarse de que la calidad de su producto siga siendo inafectada. Para nosotros como ISO 9001 certificaron a la compañía que esto es absolutamente obligatorio. Para probar la influencia del proceso de la clarificación® del laboratorio de la dinámica de Sartoclear en la calidad del producto, clarificamos una cultura de MEXi-293E (HEK293) que expresaba un anticuerpo monoclonal fundido a una Gemelo-Strep-etiqueta®, usando nuestro proceso estándar de la centrifugación paralelamente al método del laboratorio® de la dinámica de Sartoclear.

Después de que la clarificación nosotros purificara el anticuerpo de las diversas muestras clarificadas vía la purificación® del flujo de gravedad de la alta capacidad Strep-TactinXT. El eluído era analizado por SDS-PAGE, la mancha blanca /negra occidental, la medición fotométrica en 280 nanómetro y la cromatografía de la exclusión de la talla.

El SDS-PAGE y el análisis occidental de la mancha blanca /negra revelaron que no había diferencia en pureza de la proteína entre los dos métodos de la clarificación y que la pureza 100% fue lograda con la purificación® de la alta capacidad Strep-TactinXT.

El uso del laboratorio de la dinámica® de Sartoclear no influenció la agregación del anticuerpo, porque la índice del anticuerpo agregado, determinada por cromatografía de la exclusión de la talla, era lo mismo que para la muestra centrifugada.

Finalmente, encontramos que el rendimiento de la proteína era lo mismo para ambos métodos que probaron que no se limitó ningún anticuerpo a los componentes del sistema de laboratorio® de la dinámica de Sartoclear.

En resumen, el uso del método del laboratorio® de la dinámica de Sartoclear no tenía ningún efecto negativo sobre la calidad o la cantidad de proteína.

En su investigación, los anticuerpos etiqueta con la Gemelo-Strep-etiqueta® para el paso de la purificación. ¿Por qué usted utiliza este sistema de la etiqueta de la afinidad para su purificación?

El sistema de la Strep-etiqueta permite la purificación de proteínas bajo condiciones fisiológicas y de desnaturalizaciones con las purezas que exceden generalmente del 90%. Comparado al resto de los sistemas de la afinidad la Gemelo-Strep-etiqueta® conjuntamente con el Strep-TactinXT® alcanza la afinidad obligatoria más alta de alcances del P.M., mientras que el sistema todavía mantiene su reversibilidad. Esto es ventajoso específicamente para las muestras concentradas ciclón en volúmenes grandes.

Debido al tamaño pequeño del Strep-tagII® (8aa) y de la Gemelo-Strep-etiqueta® (28aa) no hay necesidad de quitar la etiqueta.

Además, el sistema es compatible con una gran variedad de reactivos como detersorios, altas concentraciones de la sal, reductores, queladores, el etc.

Estas propiedades combinadas con el hecho de que el sistema es conveniente para la purificación de la proteína de bacteriano, la levadura, el insecto y los ordenadores principal mamíferos hacen este sistema el sistema superior de la etiqueta.

Es fácil de utilizar sin la necesidad de la optimización como por ejemplo ajustar la concentración del imidazol según la elución al usar el sistema de la Su-etiqueta. Esto hace el sistema de la Strep-etiqueta la solución perfecta para los retos de la purificación de la proteína que he mencionado anterior.

En su investigación, las muestras que fueron centrifugadas no eran estéril que podría ser importante para muchos usos y requeriría un paso estéril separado de la filtración. ¿Cómo esto habría sido lograda y cómo éste habría afectado al procedimiento usado?

Filtramos la muestra con 0,2 filtros de la capota de la botella del µm si se requiere la esterilidad. Por supuesto, esto lleva a la hora de proceso adicional para la clarificación y a los costos adicionales.

La ventaja del sistema de laboratorio® de la dinámica de Sartoclear es que este paso de la filtración está incluido ya en el proceso de la clarificación.

Por lo tanto, si se requiere la esterilidad, no tenemos que agregar este paso por separado.  Esto aumenta el tiempo que salvamos usando el sistema de laboratorio® de la dinámica de Sartoclear comparado a nuestro método estándar.

¿Qué limitaciones hay para el método de Sartoclear de clarificación y de filtración de la célula mamífera?

En nuestras manos, no vemos una limitación en este método. Los utilizadores deben verificar para saber si hay la recuperación completa de su proteína recombinante después de la clarificación antes de usar este método regularmente, para estar en el lado seguro.

Las proteínas recombinantes tienen lote de potencial en una amplia gama de usos. ¿Qué adelantos usted espera ver para aumentar su capacidad de conversión a escala y uso disperso en cuanto a sus usos del R&D?

La producción de proteínas recombinantes sigue siendo una producción en un sistema de la caja negra. De hecho, hemos aprendido mucho sobre cómo las células expresan las proteínas y que pueden influenciar los factores cantidad y calidad de la proteína.

Sin embargo, muchos aspectos de cómo las proteínas de proceso de las células son todavía no entendibles. Pienso que las mejorías en análisis de estructura, el uso de CRISPR/Cas y los grandes adelantos en el campo del análisis y de la minería de datos de datos combinados con la alta automatización de la producción llevarán a un conocimiento más completo de estos procesos intracelulares. Esto a cambio llevará a los procesos de producción aerodinámicos de la proteína.

La tendencia de disminuir la escala de la expresión y de aumentar la producción de proteínas en una fase temprana de la investigación y desarrollo impulsarán la necesidad de sistemas de la purificación y los formatos que soportan procesos de esta altos producción.

¿Dónde pueden los programas de lectura encontrar más información?

Más información se puede encontrar en IBA Lifesciences, sartorio.

Sobre Dennis Karthaus, MSc

Dennis Karthaus recibió su grado principal del ` s en biotecnología de la universidad de ciencias aplicadas en Bremerhaven. Durante su tesis en el departamento de la biotecnología farmacéutica en el instituto de Fraunhofer para la toxicología y el remedio experimental él trabajó en el revelado de las plataformas de la purificación de la proteína y en el revelado de la variedad de células.

En 2012, Dennis Karthaus ensambló IBA Lifesciences. Él es responsable del servicio de encargo mamífero de la expresión y de la purificación de la proteína y del desarrollo de productos en este campo.

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