Demande de règlement unique de CRISPR peut en toute sécurité et stablement rectifier la maladie génétique

Génétique édite et la réfection de protéine dans des modèles de souris de la dystrophie musculaire de Duchenne demeurent un an viable après demande de règlement unique de CRISPR

Les chercheurs à Duke University ont prouvé qu'une demande de règlement systémique unique utilisant la technologie de retouche de génome de CRISPR peut en toute sécurité et stablement rectifier une maladie génétique -- Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) -- pour plus qu'une année chez les souris, en dépit des réactions immunitaires observées et des résultats alternatifs de retouche de gène.

L'étude apparaît en ligne le 18 février en médicament de nature de tourillon.

En 2016, Charles Gersbach, le professeur agrégé de famille de Rooney du génie biomédical au duc, le publié des premières utilisations couronnées de succès de CRISPR de traiter un modèle animal de la maladie génétique avec une stratégie qui a le potentiel d'être traduit au traitement humain. Beaucoup d'exemples complémentaires ont depuis été publiés, et plusieurs traitements de retouche de génome visant les maladies humaines sont actuel dans les tests cliniques, avec plus sur le chemin.

La dernière recherche de Gersbach se concentre sur un modèle de souris de DMD, qui est provoqué par l'incapacité du fuselage de produire la dystrophine, un long réseau de protéine qui grippe l'intérieur d'une fibre musculaire à sa structure de soutènement environnante.

La dystrophine est codée par un gène contenant 79 régions de protéine-codage, exons appelés. Si un ou plusieurs exons sont perturbés ou effacés par une mutation héritée, le réseau n'obtient pas établi, entraînant le muscle lentement déchiqueter et détériorer. La plupart des patients sont liés par fauteuil par l'âge 10 et ne vivent pas au delà de leur 20s ou début des années 1930.

Gersbach avait travaillé aux demandes de règlement génétiques potentielles pour Duchenne depuis 2009. Son laboratoire était un du premier pour commencer à se concentrer sur CRISPR/Cas9, une version modifiée d'un système de défense bactérien qui des objectifs et des parts à part l'ADN des virus de envahissement. Son approche emploie CRISPR/Cas9 pour couper à l'extérieur des exons d'un coup de ciseaux de dystrophine autour de la mutation génétique, partant du système naturel de la réparation de l'ADN du fuselage pour piquer l'arrière restante de gène ensemble pour produire diminuée -- mais fonctionnel -- version du gène de dystrophine.

« Car nous continuons à travailler pour développer des traitements génétiques basés sur CRISPR, il est critique de vérifier nos suppositions et évaluer rigoureusement tous les aspects de ceci approchez, » Gersbach a dit. « Un objectif de nos expériences était de vérifier quelques idées étant discutées dans le domaine, qui nous aidera à comprendre le potentiel de CRISPR de traiter des maladies génétiques en général et la dystrophie musculaire de Duchenne en particulier. Ceci comprend surveiller la résistance à long terme de la réaction face aux réactions immunitaires potentielles contre la protéine Cas9 bactérienne. »

La première étude de huit semaines a expliqué que la dystrophine fonctionnelle a été remise et la force musculaire a été augmentée. Elle, cependant, n'a pas exploré la résistance à long terme de la demande de règlement.

« C'est largement que la retouche de gène mène à la rectification permanente de gène, » Gersbach cru a dit. « Cependant, il est important d'explorer les possibilités théoriques qui pourraient miner les effets de la retouche de gène, tels que détruire des cellules traitées ou une réaction immunitaire. »

L'objectif de l'étude neuve était d'explorer les facteurs qui pourraient modifier les effets à long terme de la retouche de gène de CRISPR/Cas9-based.

Christopher Nelson, le camarade post-doctoral dans le laboratoire de Gersbach qui a abouti le travail, administré une dose unique du traitement de CRISPR en intraveineuse aux souris adultes et nouveau-nées transportant un gène défectueux de dystrophine. Au cours de l'année suivante, les chercheurs ont mesuré combien de cellules musculaires ont été avec succès éditées et quels types d'altérations génétiques ont été effectués, ainsi que le rétablissement de toute réaction immunitaire contre la protéine bactérienne de CRISPR, Cas9, qui agit en tant que « ciseaux » qui effectue des coupures au génome.

D'autres études ont rapporté que le système immunitaire de souris peut monter une réaction à Cas9, qui pourrait potentiellement nuire l'avantage des traitements de CRISPR. Plusieurs groupes ont également rapporté que certains ont l'immunité de préexistence aux protéines Cas9, susceptible à cause de l'exposition précédente à l'hôte bactérien.

« Les bonnes nouvelles sont que quoique nous ayons observé l'anticorps et les réactions de cellule T à Cas9, ni l'un ni l'autre n'ont semblé avoir comme conséquence n'importe quelle toxicité chez ces souris, » a indiqué le Nelson. « La réaction également n'a pas évité la capacité du traitement d'éditer avec succès le gène de dystrophine et de produire l'expression de la protéine à long terme. »

Les résultats ont également proposé des approches pour relever des défis potentiels, si ils surgissent à l'avenir. Par exemple, les chercheurs ont observé que quand de deux-jour-vieilles souris sans systèmes immunitaires en pleine maturité ont été traitées en intraveineuse, aucune réaction immunitaire n'a été trouvée. La retouche de génome de CRISPR est restée stable et, dans certains cas, même renforcée au cours d'une année. On a pu imaginer fournir le traitement aux mineurs comme méthode d'éviter ou de moduler une réaction immunitaire non désirée.

Gersbach et le Nelson reconnaissent, cependant, que le système immunitaire de souris fonctionne souvent très différemment du système immunitaire humain. Et l'examen critique nouveau-né pour DMD actuel n'est pas largement exécuté ; la plupart des diagnostics de Duchenne se produisent quand les enfants sont trois à cinq années. Pour relever ce défi, Gersbach a dit que supprimante le système immunitaire pendant la demande de règlement peut être une approche viable.

Les chercheurs vérifient également des stratégies potentielles pour limiter l'expression ou la distribution de Cas9 seulement aux durées de cellules musculaires pour faire court, qui peuvent diminuer le dépistage immunisé.

« Nous étions heureux d'observer que toutes les souris faisaient bien une année après demande de règlement, mais nos résultats prouvent qu'il faut plus d'orientation sur la réaction immunitaire pendant que nous déménageons vers de plus grands modèles animaux, » le Nelson a dit.

Le Nelson et Gersbach ont précédemment vérifié le potentiel de la retouche de hors circuit-objectif par CRISPR/Cas9 de modifier involontairement d'autres sites dans le génome et l'activité minimale rapportée aux sites susceptibles de hors circuit-objectif. D'autres études récentes, cependant, ont rapporté que CRISPR peut parfois rendre génétique édite au site correct mais pas de la façon destinée. Par exemple, quelques études ont prouvé que CRISPR peut couper destiné beaucoup plus grand génétique de parties qu'ou que les pièces d'ADN peuvent encastrer au site de la coupure. Ces types de édite avaient précédemment été non rapportés dans des études de retouche de génome parce que les méthodes étant seulement trouvés utilisés destinés éditent.

Pour tracer largement tout l'édite l'occurrence dans le gène de dystrophine, Nelson a employé un ADN ordonnançant l'approche qui enregistre agnostically que n'importe quel type de éditez. Étonnant, il y avait beaucoup de types de édite être effectué en plus du démontage destiné de l'exon visé, y compris un haut niveau de la mise en place des séquences d'ADN à partir du vecteur viral codant le système CRISPR/Cas9.

Selon le type de tissu et le dosage de CRISPR fournis, autant de comme moitié du sur-objectif édite eu comme conséquence ces variations de séquence alternatives. Bien que ce résultat ait été étonnant, les variations de séquence fortuites ne semblent pas influencer la sécurité ou l'efficacité de cette approche de retouche du gène CRISPR/Cas9 pour DMD.

« Aucun de ces derniers n'édite serait forcément un sujet d'inquiétude dans ce cas parce que le gène de dystrophine est déjà défectueux, » a dit le Nelson. « Qu'étant dit, tous les résultats fortuits pourraient potentiellement emporter du rendement du gène éditant vous essayez de réaliser, qui supporte l'importance de concevoir des voies de recenser objectivement et atténuer l'alternative édite dans de futures études. »

« Les études précédentes ont proposé que certains de ces autres types de éditent pourraient se produire, » Gersbach a dit. « Mais c'est l'une des premières mesures complètes de ces événements dans un modèle animal utilisant une approche thérapeutiquement appropriée. Avançant, ce phénomène doit être surveillé soigneusement et être compris mieux. Les méthodes qui évitent des ces alternative éditent et augmentent la fréquence du destiné éditent seront importantes pour maximiser le potentiel de la retouche de génome de traiter la maladie. »