Singolo trattamento di CRISPR può correggere sicuro e stabile malattia genetica

Le modifiche ed il ripristino genetici della proteina nei modelli del mouse della distrofia muscolare di Duchenne rimangono un anno possibile dopo il singolo trattamento di CRISPR

I ricercatori alla Duke University hanno indicato che un singolo trattamento sistemico facendo uso del genoma di CRISPR che modifica tecnologia può correggere sicuro e stabile una malattia genetica -- Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) -- per più di un anno in mouse, malgrado le risposte immunitarie osservate ed il gene alternativo che modificano i risultati.

Lo studio compare online il 18 febbraio nella medicina della natura del giornale.

Nel 2016, Charles Gersbach, il professore associato della famiglia di Rooney di assistenza tecnica biomedica a duca, pubblicato uno dei primi riusciti usi di CRISPR trattare un modello animale della malattia genetica con una strategia che ha il potenziale di essere tradotto alla terapia umana. Molti esempi supplementari da allora sono stati pubblicati e parecchio il genoma che modifica le terapie che mirano alle malattie umane è corrente nei test clinici, con più sul modo.

Ultimi fuochi della ricerca di Gersbach su un modello del mouse di DMD, che è causato dall'incapacità dell'organismo di produrre il dystrophin, una catena lunga della proteina che lega l'interno di una fibra di muscolo alla sua struttura di sostegno circostante.

Dystrophin è codificato da un gene che contiene 79 regioni di proteina-codifica, chiamate esoni. Se uno o più esoni sono interrotti o cancellati da una mutazione ereditata, la catena non ottiene costruita, inducendo il muscolo a tagliuzzare e deteriorarsi lentamente. La maggior parte dei pazienti sono costretti sulla sedia a rotelle dall'età 10 e non vivono oltre il loro 20s o inizio degli anni 30.

Gersbach sta lavorando ai trattamenti genetici potenziali per Duchenne dal 2009. Il suo laboratorio era uno del primo da cominciare a mettere a fuoco su CRISPR/Cas9, una versione modificata di un sistema di difesa batterico che obiettivi e fette a parte il DNA dei virus d'invasione. Il suo approccio usa CRISPR/Cas9 per tagliare fuori gli esoni del dystrophin intorno alla mutazione genetica, lasciante il meccanismo di riparazione naturale del DNA dell'organismo per cucire insieme la parte posteriore restante del gene per creare accorciata -- ma funzionale -- versione del gene del dystrophin.

“Poichè continuiamo a lavorare per sviluppare alle le terapie genetiche basate CRISPR, è critico verificare i nostri presupposti e rigorosamente valutare tutti gli aspetti di questo avvicini a,„ Gersbach ha detto. “Uno scopo dei nostri esperimenti era di verificare alcune idee che sono discusse nel campo, che ci aiuterà a capire il potenziale di CRISPR di trattare le malattie genetiche in generale e la distrofia muscolare di Duchenne in particolare. Ciò comprende il video della durevolezza a lungo termine della risposta di fronte alle risposte immunitarie potenziali contro la proteina batterica Cas9.„

Il primo studio di otto settimane ha dimostrato che il dystrophin funzionale sono stati riparati e la forza muscolare aumentata. , Tuttavia, non ha esplorato la durevolezza a lungo termine del trattamento.

“È ampiamente che modificare del gene piombo alla correzione permanente del gene,„ Gersbach creduto ha detto. “Tuttavia, è importante esplorare le possibilità teoriche che potrebbero insidiare gli effetti del gene che modificano, come perdita le celle curate o della risposta immunitaria.„

Lo scopo di nuovo studio era di esplorare i fattori che potrebbero alterare gli effetti a lungo termine di modificare del gene di CRISPR/Cas9-based.

Christopher Nelson, il collega post-dottorato nel laboratorio di Gersbach che piombo il lavoro, amministrato un d'una sola dose della terapia di CRISPR per via endovenosa sia ai mouse adulti che neonati che portano un gene difettoso del dystrophin. Nel corso di seguente anno, i ricercatori hanno misurato quante celle di muscolo sono state modificate con successo e che tipo di alterazioni genetiche sono state fatte come pure la generazione di qualsiasi risposta immunitaria contro la proteina batterica di CRISPR, Cas9, che funge da “forbici„ che fa i tagli al genoma.

Altri studi hanno riferito che il sistema immunitario del mouse può montare una risposta a Cas9, in grado di potenzialmente interferire con il vantaggio delle terapie di CRISPR. Parecchi gruppi egualmente hanno riferito che qualche gente ha immunità di preesistenza alle proteine Cas9, probabile a causa dell'esposizione precedente al host batterico.

“Le buone notizie sono che anche se abbiamo osservato sia l'anticorpo che le risposte di cellula T a Cas9, nessune sono sembrato provocare tutta la tossicità in questi mouse,„ ha detto il Nelson. “La risposta egualmente non ha impedito la capacità della terapia di modificare con successo il gene del dystrophin e di produrre l'espressione a lungo termine della proteina.„

I risultati egualmente hanno indicato gli approcci alle sfide potenziali di indirizzo, se sorgono in futuro. Per esempio, i ricercatori hanno osservato che quando i due-giorno-vecchi mouse senza sistemi immunitari a sviluppo completo sono stati trattati per via endovenosa, nessuna risposta immunitaria è stata individuata. Modificare del genoma di CRISPR è rimanere stabile e, anche rinforzato in alcuni casi nel corso di un anno. Si ha potuto immaginare consegnare la terapia agli infanti come metodo di aggiramento o di modulazione della risposta immunitaria indesiderata.

Gersbach ed il Nelson riconoscono, tuttavia, che il sistema immunitario del mouse funziona spesso abbastanza diversamente dal sistema immunitario umano. E la selezione neonata per DMD corrente ampiamente non è realizzata; la maggior parte delle diagnosi di Duchenne accadono quando i bambini hanno tre - cinque anni. Per indirizzare questa sfida, Gersbach ha detto che sopprimente il sistema immunitario durante il trattamento può essere un approccio possibile.

I ricercatori egualmente stanno studiando le strategie potenziali per limitare l'espressione o la consegna di Cas9 soltanto alle durate delle cellule di muscolo in breve, che possono diminuire la rilevazione immune.

“Eravamo soddisfatti di osservare che tutti i mouse stessero facendo bene un anno dopo il trattamento, ma i nostri risultati indicano che deve essere più fuoco sulla risposta immunitaria mentre avanziamo verso i più grandi modelli animali,„ il Nelson ha detto.

Il Nelson e Gersbach precedentemente hanno studiato il potenziale dell'fuori obiettivo che modifica da CRISPR/Cas9 per modificare involontario altri siti nel genoma ed hanno riferito l'attività minima ai siti probabili dell'fuori obiettivo. Altri studi recenti, tuttavia, hanno riferito che CRISPR può a volte fare le modifiche genetiche al sito corretto ma non nel modo progettato. Per esempio, alcuni studi hanno indicato che CRISPR può tagliare progettato genetico delle sezioni molto più grande di quanto o che i pezzi di DNA possono incassare al sito del taglio. Questi tipi di modifiche precedentemente erano stati non riferiti in genoma che modifica gli studi perché i metodi che sono usando soltanto individuati la modifica progettata.

Per mappare completamente tutte le modifiche che accadono nel gene del dystrophin, il Nelson ha usato un DNA che ordina l'approccio che agnostically riferisce qualunque tipo di modifica. Sorprendente, c'erano molti tipi di modifiche che sono fatte oltre alla rimozione progettata dell'esone mirato a, compreso un ad alto livello dell'inserzione delle sequenze del DNA dal vettore virale che codifica il sistema CRISPR/Cas9.

Secondo il tipo di tessuto ed il dosaggio di CRISPR consegnati, altrettanto come metà delle modifiche dell'su obiettivo ha provocato questi cambiamenti alternativi di sequenza. Sebbene questo risultato sia sorprendente, i cambiamenti non intenzionali di sequenza non sembrano urtare la sicurezza o l'efficacia di questo gene CRISPR/Cas9 che modifica l'approccio per DMD.

“Nessuno di queste modifiche necessariamente sarebbero una fonte di preoccupazioni in questo caso perché il gene del dystrophin è già difettoso,„ hanno detto il Nelson. “Che essendo dicendo, tutti i risultati non intenzionali potrebbero potenzialmente portare via dal risparmio di temi del gene che modifica state provando a raggiungere, che supporta l'importanza di progettazione dei modi identificare ed attenuare obiettivamente le modifiche di alternativa negli studi futuri.„

“Gli studi precedenti hanno suggerito che alcuni di questi altri tipi di modifiche potrebbero accadere,„ Gersbach hanno detto. “Ma questa è una delle prime misure complete di questi eventi in un modello animale facendo uso di un approccio dal punto di vista terapeutico pertinente. Muovendosi in avanti, questo fenomeno deve essere riflesso con attenzione ed essere capito meglio. I metodi che evitano queste modifiche alternative ed aumentano la frequenza della modifica progettata saranno importanti a massimizzare il potenziale del genoma che modifica per trattare la malattia.„