Único tratamento de CRISPR pode com segurança e estàvel corrigir a doença genética

Genético edita e a restauração da proteína em modelos do rato da distrofia muscular de Duchenne permanece um ano viável após o único tratamento de CRISPR

Os pesquisadores em Duke University mostraram que um único tratamento sistemático que usa o genoma de CRISPR que edita a tecnologia pode com segurança e estàvel corrigir uma doença genética -- Distrofia muscular de Duchenne (DMD) -- para mais do que um ano nos ratos, apesar das respostas imunes observadas e do gene alternativo editando resultados.

O estudo aparece em linha o 18 de fevereiro na medicina da natureza do jornal.

Em 2016, Charles Gersbach, professor adjunto da família de Rooney da engenharia biomedicável no duque, publicado um dos primeiros usos bem sucedidos de CRISPR tratar um modelo animal da doença genética com uma estratégia que tenha o potencial ser traduzido à terapia humana. Muitos exemplos adicionais têm sido publicados desde, e diverso o genoma que edita as terapias que visam doenças humanas está actualmente nos ensaios clínicos, com o mais na maneira.

A pesquisa a mais atrasada de Gersbach centra-se sobre um modelo do rato de DMD, que é causado pela incapacidade do corpo produzir o dystrophin, uma corrente longa da proteína que ligue o interior de uma fibra de músculo a sua estrutura circunvizinha do apoio.

Dystrophin é codificado por um gene que contem 79 regiões da proteína-codificação, chamadas exons. Se uns ou vários exons são interrompidos ou suprimidos por uma mutação herdada, a corrente não obtem construída, causando o músculo lentamente ao fragmento e não se deteriora. A maioria de pacientes são em cadeira de rodas pela idade 10 e não vivem além de seu 20s ou 30s adiantado.

Gersbach tem trabalhado em tratamentos genéticos potenciais para Duchenne desde 2009. Seu laboratório era um do primeiro para começar a focalizar em CRISPR/Cas9, uma versão alterada de um sistema de defesa bacteriano que alvos e fatias distante o ADN de vírus de invasão. Sua aproximação usa CRISPR/Cas9 para cortar para fora exons do dystrophin em torno da mutação genética, saindo do sistema natural do reparo do ADN do corpo para costurar junto a parte traseira restante do gene para criar encurtada -- mas funcional -- versão do gene do dystrophin.

“Porque nós continuamos a trabalhar para desenvolver terapias genéticas CRISPR-baseadas, é crítico testar nossas suposições e para avaliar rigorosa todos os aspectos disto aproxime,” Gersbach disse. “Um objetivo de nossas experiências era testar algumas ideias que estão sendo discutidas no campo, que nos ajudará a compreender o potencial de CRISPR tratar doenças genéticas geralmente e distrofia muscular de Duchenne em particular. Isto inclui a monitoração da durabilidade a longo prazo da resposta face às respostas imunes potenciais contra a proteína Cas9 bacteriana.”

O primeiro estudo de oito-semana demonstrou que o dystrophin funcional estiveram restaurados e a força de músculo aumentada. , Contudo, não explorou a durabilidade a longo prazo do tratamento.

“É extensamente que a edição do gene conduz à correcção permanente do gene,” Gersbach acreditado disse. “Contudo, é importante explorar as possibilidades teóricas que poderiam minar os efeitos do gene que editam, como a perda de pilhas tratadas ou de uma resposta imune.”

O objetivo do estudo novo era explorar os factores que poderiam alterar os efeitos a longo prazo da edição do gene de CRISPR/Cas9-based.

Christopher Nelson, companheiro cargo-doutoral no laboratório de Gersbach que conduziu o trabalho, administrado uma única dose da terapia de CRISPR intravenosa aos ratos adultos e recém-nascidos que levam um gene defeituoso do dystrophin. No curso do seguinte ano, os pesquisadores mediram quantas pilhas de músculo foram editadas com sucesso e que tipos de alterações genéticas foram feitos, assim como a geração de toda a resposta imune contra a proteína bacteriana de CRISPR, Cas9, que actua como “scissors” que faz cortes ao genoma.

Outros estudos relataram que o sistema imunitário do rato pode montar uma resposta a Cas9, que poderia potencial interferir com o benefício de terapias de CRISPR. Diversos grupos igualmente relataram que alguns povos têm a imunidade de preexistência às proteínas Cas9, provável devido à exposição precedente ao anfitrião bacteriano.

“A boa notícia é que mesmo que nós observemos o anticorpo e as respostas do t cell a Cas9, nenhumas pareceram conduzir a toda a toxicidade nestes ratos,” disse Nelson. “A resposta igualmente não impediu a capacidade da terapia para editar com sucesso o gene do dystrophin e para produzir a expressão a longo prazo da proteína.”

As aproximações igualmente sugeridas dos resultados para endereçar desafios do potencial, se elevararem no futuro. Por exemplo, os pesquisadores observaram que quando os ratos dois-dia-velhos sem sistemas imunitários plenamente desenvolvidos foram tratados intravenosa, nenhuma resposta imune estêve detectada. A edição do genoma de CRISPR permaneceu estável e, em alguns casos, reforçada mesmo no curso de um ano. Se podia imaginar entregar a terapia aos infantes como um método de contornar ou de modular uma resposta imune indesejável.

Gersbach e Nelson reconhecem, contudo, que o sistema imunitário do rato funciona frequentemente bastante diferentemente do sistema imunitário humano. E a selecção recém-nascida para DMD não é executada actualmente extensamente; a maioria de diagnósticos de Duchenne ocorrem quando as crianças têm três a cinco anos velhas. Para endereçar este desafio, Gersbach disse que de supressão o sistema imunitário durante o tratamento pode ser uma aproximação viável.

Os pesquisadores igualmente estão investigando estratégias potenciais para restringir para breve a expressão ou a entrega de Cas9 somente às durações das pilhas de músculo, que podem diminuir a detecção imune.

“Nós éramos satisfeitos observar que todos os ratos faziam bem um ano após o tratamento, mas nossos resultados mostram que precisa de estar mais foco na resposta imune como nós nos movemos para modelos animais maiores,” Nelson disse.

Nelson e Gersbach têm investigado o potencial do fora-alvo que edita por CRISPR/Cas9 para alterar involuntàriamente outros locais no genoma e têm relatado previamente a actividade mínima em locais prováveis do fora-alvo. Outros estudos recentes, contudo, relataram que CRISPR pode às vezes fazer genético edita no local correcto mas não na maneira pretendida. Por exemplo, alguns estudos mostraram que CRISPR pode cortar pretendida do que muito maior genética das secções ou que as partes de ADN podem encaixar no local do corte. Estes tipos de editam tinham sido previamente não-relatados no genoma que edita estudos porque os métodos que são somente detectados usados pretendidos editam.

Para traçar detalhada todo o edita a ocorrência no gene do dystrophin, Nelson usou um ADN que arranja em seqüência a aproximação que relata agnostically que qualquer tipo de edite. Surpreendentemente, havia muitos tipos de edita a factura além do que a remoção pretendida do exon visado, incluindo um nível elevado de inserção de seqüências do ADN do vector viral que codifica o sistema CRISPR/Cas9.

Segundo o tipo de tecido e a dosagem de CRISPR entregados, tanta como como a metade do em-alvo edita conduzido a estas mudanças alternativas da seqüência. Embora este resultado seja surpreendente, as mudanças sem intenção da seqüência não parecem impactar a segurança ou a eficácia deste gene CRISPR/Cas9 que edita a aproximação para DMD.

“Nenhuma destes edita seria necessariamente um motivo de preocupação neste caso porque o gene do dystrophin é já defeituoso,” disse Nelson. “Que sendo dito, todos os resultados sem intenção poderiam potencial levar embora da eficiência do gene que edita você está tentando conseguir, que apoia a importância de projetar maneiras de identificar objetiva e para abrandar a alternativa edita nos estudos futuros.”

“Os estudos precedentes sugeriram que alguns destes outros tipos de editassem poderiam acontecer,” Gersbach disse. “Mas esta é uma das primeiras medidas detalhadas destes eventos em um modelo animal usando uma aproximação terapêutica relevante. Movendo-se para a frente, este fenômeno precisa de ser monitorado com cuidado e de ser compreendido melhor. Os métodos que evitam estes alternativa editam e aumentam a freqüência do pretendido editam serão importantes para o aumento do potencial do genoma que edita para tratar a doença.”