Totalisation submicronique de sondage de protéine utilisant le fractionnement asymétrique d'Inducteur-Flux de flux, l'AF4, et la dispersion de la lumière


insights from industryKim R Williams
Dr. Christoph Johann

Wyatt Technology

L'instrumentation de dispersion de la lumière est très utilisée dans la caractérisation des macroparticles et des nanoparticles en solution. Elle fournit des outils de tranchant pour déterminer la masse, la taille, la conformation, la charge, et les interactions molaires absolues utilisant la dispersion de la lumière de multi-cornière (MALS), la viscométrie différentielle, le fractionnement d'inducteur-flux (FFF), la dispersion de la lumière dynamique (DLS), la mobilité électrophorétique et les gradients de composition.

Les la plupart des développements récents par Wyatt en leur instrumentation et logiciel ont effectué le plein potentiel de FFF accessible à une base de clients plus large. Dans cette entrevue, Kim R. Williams et Christoph Johann parlent à Nouvelles-Médical et aux sciences de la vie au sujet des technologies et de leur recherche.

Quelles sont les caractéristiques les plus proéminentes de FFF ? Pourquoi devrions-nous employer FFF ?

CJ : D'abord, nous devrions observer les caractéristiques les plus proéminentes de FFF. FFF sépare matériel des échantillons selon la taille, pour cette raison il nous permet de rassembler des fractions. Avec le système de l'éclipse FFF nous pouvons séparer des entités seulement de quelques nanomètres jusqu'aux micromètres dans la taille. En outre, la technique est douce, exerçant les forces de cisaillement inférieures, et non destructif.

FFF est particulièrement puissant une fois utilisé conjointement avec MALS, qui fournit la masse et la taille molaires absolues des fractions éluées. Puisqu'il combine la séparation basée sur taille avec la dispersion de la lumière en ligne, il a plus de haute résolution le lot que normal, ou non fractionné, DLS.

En outre, je pense le logiciel neuf de DPS de SCOUT que le développement hors ligne de méthode de supports est une fonctionnalité supplémentaire passionnante. Ce logiciel réduit à un minimum le nombre d'expériences exigées pour le développement de méthode. Je peux obtenir un résultat optimal avec juste quelques injections plutôt que passant des heures dans le laboratoire.

Quel type de données est obtenu à partir des expériences de FFF ?

CJ : Nous pouvons obtenir des distributions détaillées de la masse molaire absolue et de radius de RMS des analyses de dispersion de la lumière de multi-cornière à chaque volume d'élution. De plus, nous pouvons prévoir le radius hydrodynamique à chaque volume d'élution de la dispersion de la lumière dynamique ou le dériver du temps d'assemblage de FFF.

Pour des macromolécules la concentration est dérivée d'un UV ou du détecteur d'indice de réfraction afin d'obtenir des distributions quantitatives, alors que pour des nanoparticles la distribution de la concentration de particules est mesurée seule de la dispersion de la lumière.

Comment vous assurez-vous que les protéines n'agissent pas l'un sur l'autre avec la membrane AF4 ?

KRW : Il est important de vérifier qu'il n'y a aucune interaction entre la protéine et la membrane utilisées dans AF4, en particulier quand AF4 est employé pour prévoir la dimension particulaire des temps d'assemblage.

Je pense qu'il est toujours sage de faire un premier passage sans le croisement de flux, pour s'assurer qu'assez d'échantillon a été injecté et une crête très grande est obtenue en détecteurs. Si vous vous trouvez dans la situation drastique de la perte complète d'échantillon, vous pouvez pouvoir la rectifier en diminuant l'intensité de champ ou le régime de croisement de flux.

Les interactions peuvent également être réduites en préconditionnant la membrane, par exemple en injectant une solution de protéine, ou en réduisant la charge de sel. Je constate qu'une solution du chlorure de sodium 50 millimolar, ou même de la solution tampon de phosphate sans le sel ajouté du tout, améliore la définition et la guérison dans FFF. Vous ne devez pas toujours employer des tampons de PBS avec du chlorure de sodium 150 millimolar de même que courant en chromatographie MALS de taille-exclusion.

Pouvez-vous décrire l'éclipse FFF ?

CJ : Je pense que la chose la plus importante est que l'éclipse FFF est facile à utiliser, tandis qu'étant un système puissant et robuste. Il combine trois fonctionnalités clé :  intégration parfaite ; pleine automatisation du système complet et des capacités informatiques considérables.

Il est grand de pouvoir intégrer le flux de travail complet du développement de méthode au résultat final utilisant la plate-forme logiciel neuve de la VISIBILITÉ CSH. Ceci comprend la demande de VOYAGER CDS d'expériences de contrôle et de fonctionnement d'instrument et la demande de DPS de SCOUT de traitement de données et de développement de méthode.

J'espère que nos nouveautés en instrumentation et logiciel effectueront le plein potentiel de FFF accessible à plus d'usagers.

Comment employez-vous le SCOUT pour le développement de méthode ?

CJ : Le SCOUT nous aide à choisir le bon programme de flux pour réaliser la séparation désirée. Nous devons juste entrer la géométrie de glissière que nous voulons et la gamme assumée de dimension particulaire pour nos échantillons dans le SCOUT, installons un programme et une ligne droite nominaux de flux elle nous donnera un fractogram prévu.

Le programme de flux comprend le débit de glissière et l'évolution du régime d'écoulement transversal avec du temps. Les crêtes prévues sont montrées immédiatement avec des leurs temps d'assemblage prévus, et il nous donne également la dilution maximale. Nous pouvons changer des paramètres, tels que des longueurs de glissière ou des débits, pour voir ce que serait l'effet. C'est tout rapidement déterminé par le logiciel, nous sauvegardant temps considérable de laboratoire.

Dans notre expérience, les prévisions de SCOUT sont très précises et suivent de près les traces UV des expériences réelles.

De cette façon, elle est droite pour que nous trouvent une méthode qui donne une définition adaptée. Une fois que nous avons sélecté la technique adaptée, nous pouvons l'exporter à VOYAGER, qui fera fonctionner l'expérience.

Comment va-t-il FFF aide-t-il à comprendre la cinétique de totalisation d'un anticorps ? Quels sont les défis en analysant les médicaments biologiques ?

KRW : Les médicaments conventionnels sont type des petites molécules préparées dans des capsules aux tablettes qui ont une longue durée de conservation. En revanche, le biotherapeutics ou les médicaments biologiques sont de grandes molécules complexes qui sont morphologiquement hétérogènes.

Ils sont préparés en solution et administrés par l'injection ou l'infusion intraveineuse de seringue. Les défis principaux liés à leur analyse proviennent du fait qu'ils tendent à être instables et sensibles à la tension.

Il est pour cette raison important que nous emploient un procédé analytique qui ne dégrade pas ou ne dénature pas le médicament biologique. Il y a des étapes et des facteurs de stress de traitement multiple qui pourraient mener à la dénaturation irréversible, telle que la température, le pH, et la composition de solution.

Si un monomère d'anticorps est dénaturé, la totalisation et la précipitation se produisent, qui réduiront son efficacité quand injecté dans un patient et augmentent son potentiel pour l'immunogénicité. Il est également important de distinguer ces ensembles de protéine et contaminants étrangers possibles, tels qu'un microdroplet d'huile de silicone, des bulles d'air, ou même des éclats de tesson ou en caoutchouc en verre.

Quelles techniques peuvent être employées pour caractériser des ensembles de protéine ?

KRW : La technique utilisée dépend réellement de la taille de la protéine. Il y a plusieurs techniques pour des protéines au-dessus d'un micromètre mais il y a très peu de techniques pour analyser des protéines de l'ordre des nanomètres jusqu'à un micromètre.

la chromatographie de Taille-exclusion (SEC) est actuel la méthode la plus utilisée généralement pour regarder des ensembles de protéine, mais il n'est pas idéal. Tout d'abord, la composition de phase mobile est limitée, et ceci réduit à un minimum l'atténuation de l'absorption sur les surfaces d'emballage de fléau. Deuxièmement, le pore procurable classe la limite la gamme des tailles que chaque fléau peut séparer.

Troisièmement, le fléau bourré entraînera la dégradation de cisaillement, qui est particulièrement problématique quand des ensembles passagers sont étudiés. En conclusion, pour éviter le fléau branchant, des échantillons sont habituellement filtrés ou ultracentrifugé et il n'y a aucune connaissance de avec précision ce qui est retiré pendant ce procédé.

Nous avons développé une méthode simple basée sur l'asymétrique-flux FFF (AF4) en combination avec la dispersion de la lumière pour satisfaire le besoin d'informations sur ce qui est détruit dans sec : de plus grands ensembles ou ceux qui subissent le cisaillement sur le fléau. Il nous permet d'obtenir l'information sur les ensembles submicroniques de protéine.

Pouvez-vous nous dire davantage au sujet des avantages de cette méthodologie ?

KRW : l'Asymétrique-flux FFF comporte la séparation des composantes dans une glissière ouverte, utilisant aucun matériau d'emballage. Un inducteur est perpendiculaire appliquée à l'axe de séparation pour former le croisement de flux. L'utilisation d'une glissière ouverte permet pour exécuter des séparations en travers d'une classe de grandeur grande, enjambant d'un nanomètre jusqu'aux dizaines de micromètres. Cependant, nous trouvons qu'elle se comporte le plus bien pour des macromolécules de l'ordre de 104 à plus grand que 108 Daltons.

Il y a beaucoup de souplesse concernant le choix du liquide de transporteur car il y a moins interactions avec la surface de séparation.

De plus, nous le trouvons utile de pouvoir ajuster facilement les séparations en réglant le régime de croisement de flux, qui change consécutivement l'intensité de champ et puis également le temps d'assemblage.

AF4 a des avantages par rapport à la chromatographie de taille-exclusion en analysant de plus grandes analytes de 100 nanomètres et ci-avant, qui comprend des ensembles d'anticorps.

Est-ce qu'ainsi comment ce combinée avec la dispersion de la lumière est de la technologie ?

KRW : Le temps d'assemblage dans AF4 peut être lié à un coefficient de diffusion de translation qui peut consécutivement être lié à un radius hydrodynamique utilisant l'équation de Charger-Einstein. Essentiellement, AF4 réalise la séparation basée sur la taille hydrodynamique.

Une fois que les échantillons taille-ont été séparés par AF4 ils sont exposés à un détecteur en ligne de lumière-dispersion. Si un détecteur de lumière-dispersion (MALS) de multi-cornière est employé, des mesures du radius molaire de moyenne carrée de la masse et de fond peuvent être obtenues. Si un détecteur dynamique (DLS) de lumière-dispersion est employé, on peut dont mesurer le coefficient de diffusion de translation à partir le radius hydrodynamique peut être prévu utilisant charge l'équation d'Einstein.

AF4 et la dispersion de la lumière sont des techniques complémentaires avec des capacités synergiques importantes. AF4 peut prélever un échantillon hétérogène et polydispersé et le séparer dans les fractions mono-dispersées. MALS et DLS alors fournissent une mesure orthogonale de la masse molaire et la classent. Ces valeurs peuvent être comparées aux valeurs AF4 prévues utilisant la théorie AF4.

Comment AF4 MALS peut-il être employé pour étudier la cinétique de totalisation de protéine ?

KRW : Il y a quatre étapes fondamentales à la formation d'un ensemble de protéine. L'étape 1 est l'association partielle de déploiement et de réversible avec de l'autre monomère réactif ; L'étape 2 est formation totale irréversible de noyau ; L'étape 3 est la polymérisation à chaînes ; et l'étape 4 est condensation totale. Le résultat final est la formation de la substance submicronique de la masse soluble de haut-molaire, est qui ce que nous essayons de caractériser

Le modèle nucléé de totalisation (LENP) de polymérisation de Lumry-Eyring fournit une description quantitative plus complète de la cinétique non-indigène de totalisation que des versions précédentes pendant qu'il entoure toutes ces différentes étapes. Le modèle de LENP évalue trois calendriers différents : le moment pour la nucléation (t)n ; les temps pour la polymérisation de modification (t)g ; et le moment pour la condensation totale (t)c.

Utilisant une suite d'équations, tn, tg et tc peuvent être déterminés si la fraction de monomère et la masse molaire des ensembles peuvent être déterminées en fonction du temps. Et ceci peut être réalisé avec AF4 et MALS.

Quand nous nous sommes appliqués la technique à un échantillon d'anti-streptavidin IgG1, nous avons vu deux crêtes. La première crête s'est produite à sept et à une moitié de minutes, et c'était pour un monomère de 150 kilodalton (qui correspond à la masse molaire pour anti-streptavidin IgG1). La deuxième crête, que nous avons vue après environ neuf mn, était pour les ensembles. Ainsi, nous sommes parvenus à séparer des monomères et des ensembles.

La surveillance de la taille de ces crêtes nous a permise d'étudier les effets de la tension, tels que la chaleur, sur la protéine étant surveillée. Sans la chaleur il y avait seulement une crête pour le monomère de 150 kilodalton. Pendant que la chaleur était appliquée, nous avons vu que la crête totale être évident et elle ont augmenté dans la taille au fil du temps comme plus de la protéine a été dénaturée par l'exposition à la chaleur. La taille de la crête de monomère a été alors tracée en fonction du temps de tension. Les points d'informations d'AF4-MALS ont montré la perte croissante de monomère à mesure que le temps de tension augmente. De la ligne de l'ajustement, nous pourrions alors déterminer des valeurs pour tn, tc et T.g

De cette façon, utilisant des analyses d'AF4 et de MALS, nous avons prouvé que les échantillons de centrifugation, une pratique commune avant la chromatographie de taille-exclusion, modifications les calendriers pour chacune des opérations : l'opération de nucléation, l'opération de polymérisation à chaînes, et l'opération totale de condensation. Dans le cas d'anti-streptavidin IgG1, la modification n'était pas assez grande pour changer la cinétique de la totalisation.

Quel est l'effet de la séparation AF4 sur des ensembles de protéine ?

KRW : Nous avons évalué la stabilité des ensembles de protéine utilisant FFF après contrainte due à la chaleur et après ajout d'acide citrique. Nous pourrions suivre l'ampleur des modifications à l'échantillon au fil du temps.

Nous avons constaté que l'opération AF4 s'orientante n'a pas produit les anti-streptavidin ensembles IgG1. La composition liquide de transporteur, cependant, a affecté la stabilité totale, et l'association totale tendue pour se produire pendant la dilution.

La dilution dans AF4 se produit principalement à la prise de glissière et pas pendant le procédé de séparation. Ceci peut fournir une situation plus pardonnante pour séparer les analytes concentration-sensibles que la chromatographie de taille-exclusion.

Comment AF4 et chromatographie MALS de taille-exclusion comparent-ils pour des études de totalisation de protéine ?

La chromatographie de Taille-exclusion de KRW et les AF4 sont des techniques de séparation basées sur taille complémentaires. la chromatographie de Taille-exclusion a une meilleure définition pour de petits oligomères, alors qu'AF4 est meilleur pour analyser les ensembles de masse molaires évolués, particulièrement tels qui sont à effort de cisaillement enclin.

Les études cinétiques qualitatives prouvent qu'AF4 peut même monter aux ensembles de 20 micromètres, qui est une classe de grandeur non possible avec la chromatographie de taille-exclusion.

Nous croyons qu'AF4 MALS peut donner des analyses importantes dans les mécanismes cinétiques et activer des études de stabilité d'ensembles.

Où peuvent nos lecteurs aller découvrir plus ?

Pour découvrir veuillez davantage pour visiter le https://www.wyatt.com/library/webinars/probing-submicron-protein-aggregation-using-asymmetrical-flow-field-flow-fractionation-af4-and-light-scattering.html et le www.wyatt.com/Eclipse

Au sujet de Kim R Williams

Kim R Williams est professeur de chimie à l'école du Colorado des mines qui ont conduit son travail doctoral de goujon avec l'inventeur du fractionnement d'Inducteur-Flux, défunt professeur J. Calvin Giddings. La recherche de M. Williams comprend des connaissances de base de avancement de FFF et FFF se développant avec la dispersion de la lumière comme une plate-forme simultanément pour séparer et caractériser les polymères complexes, les protéines, les ensembles moléculaires superbes et les systèmes de nanoparticle.

M. Christoph Johann

M. Christoph Johann est le chef de produit global pour des produits de l'éclipse FFF à la technologie de Wyatt. Il a été en activité dans l'analyse de polymère et de biopolymère pendant plus de 30 années et a fondé la filiale européenne principale de la technologie de Wyatt. M. Johann était impliqué dans le développement de l'instrumentation de l'éclipse FFF de Wyatt.

 

 

 

 

 

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    Wyatt Technology. (2019, March 27). Totalisation submicronique de sondage de protéine utilisant le fractionnement asymétrique d'Inducteur-Flux de flux, l'AF4, et la dispersion de la lumière. News-Medical. Retrieved on October 22, 2019 from https://www.news-medical.net/news/20190327/Probing-Submicron-Protein-Aggregation-using-Asymmetrical-Flow-Field-Flow-Fractionation-AF4-and-Light-Scattering.aspx.

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    Wyatt Technology. 2019. Totalisation submicronique de sondage de protéine utilisant le fractionnement asymétrique d'Inducteur-Flux de flux, l'AF4, et la dispersion de la lumière. News-Medical, viewed 22 October 2019, https://www.news-medical.net/news/20190327/Probing-Submicron-Protein-Aggregation-using-Asymmetrical-Flow-Field-Flow-Fractionation-AF4-and-Light-Scattering.aspx.