Aggregazione di sondaggio della proteina di submicron facendo uso del frazionamento asimmetrico di Campo-Flusso di flusso, di AF4 e dello scattering leggero


insights from industryKim R Williams
Dr. Christoph Johann

Wyatt Technology

La strumentazione leggera di scattering è ampiamente usata nella caratterizzazione dei macroparticles e delle nanoparticelle in soluzione. Fornisce gli strumenti dell'avanguardia per la determinazione della massa molare assoluta, dimensione, conformazione, tassa e le interazioni facendo uso dell'multi-angolo accendono lo scattering (MALS), la viscosimetria differenziale, il frazionamento di campo-flusso (FFF), lo scattering leggero dinamico (DLS), la mobilità elettroforetica ed i gradienti di composizione.

Gli sviluppi più recenti da Wyatt nella loro strumentazione e software hanno fatto la piena capacità di FFF accessibile ad un'più ampia base di utenti. In questa intervista, Kim R. Williams e Christoph Johann parlano con scienze biologiche e Notizia-Mediche circa le tecnologie e la loro ricerca.

Che cosa sono le funzionalità più prominenti di FFF? Perché dovremmo usare FFF?

CJ: In primo luogo, dovremmo esaminare le funzionalità più prominenti di FFF. FFF separa fisicamente i campioni secondo la dimensione, quindi permette che noi raccogliamo le frazioni. Con il sistema di eclipse FFF possiamo separare le entità soltanto da alcuni nanometri fino ai micrometri nella dimensione. Ancora, la tecnica è delicata, esercitando le forze di taglio basse e non distruttivo.

FFF è particolarmente potente una volta usato insieme con MALLES VENOSTA, che fornisce la massa e la dimensione molari assolute delle frazioni eluite. Poiché combina alla la separazione basata a dimensione con lo scattering leggero online, ha più di alta risoluzione batch standard, o non frazionato, DLS.

Inoltre, penso il nuovo software del DPS dell'ESPLORATORE che lo sviluppo offline di metodo di sostegni è una funzionalità supplementare emozionante. Questo software minimizza il numero degli esperimenti richiesti per lo sviluppo di metodo. Posso ottenere un risultato ottimale con appena alcune iniezioni piuttosto che spendendo le ore in laboratorio.

Che tipo di dati sono ottenuti dagli esperimenti di FFF?

CJ: Possiamo ottenere le distribuzioni dettagliate della massa molare assoluta e del raggio di RMS dalle analisi di scattering dell'indicatore luminoso di multi-angolo ad ogni volume di eluizione. Inoltre, possiamo calcolare il raggio idrodinamico ad ogni volume di eluizione dallo scattering leggero dinamico o derivarlo a partire dal tempo di conservazione di FFF.

Per le macromolecole la concentrazione è derivata da un rivelatore di indice di rifrazione o UV per ottenere le distribuzioni quantitative, mentre per le nanoparticelle la distribuzione di concentrazione della particella è quantificata dallo scattering leggero da solo.

Come vi assicurate che le proteine non interagiscano con la membrana AF4?

KRW: È importante verificare che non ci siano interazioni fra la proteina e la membrana utilizzate in AF4, specialmente quando AF4 sta usando per calcolare la dimensione delle particelle a partire dai tempi di conservazione.

Penso che sia sempre saggio fare un'esecuzione iniziale senza il flusso incrociato, per assicurarsi che abbastanza campione sia stato iniettato e un picco molto grande è ottenuto in rivelatori. Se vi trovate nella situazione drastica di perdita completa del campione, potete potere rettificarla facendo diminuire l'intensità di campo o la tariffa del flusso incrociato.

Le interazioni possono anche essere diminuite presupponendo la membrana, per esempio iniettando una soluzione della proteina, o diminuendo il caricamento del sale. Trovo che una soluzione di cloruro di sodio millimolar 50, o persino di tampone fosfato senza sale aggiunto affatto, migliora sia la risoluzione che il ripristino in FFF. Non dovete sempre utilizzare i buffer di PBS con il cloruro di sodio millimolar 150 come è comune in cromatografia MALLES VENOSTA di dimensione-esclusione.

Potete descrivere l'eclipse FFF?

CJ: Penso che la maggior parte della cosa importante sia che l'eclipse FFF è di facile impiego, mentre essendo un sistema potente e robusto. Combina tre caratteristiche fondamentali:  integrazione senza cuciture; automazione completa del sistema completo e di estese capacità dell'elaborazione dei dati.

È grande da potere da integrare il flusso di lavoro completo dallo sviluppo di metodo al risultato finale facendo uso di nuova piattaforma software della VISIONE CSH. Ciò comprende la domanda dei CD di VOYAGER di esperimenti di controllo e di funzionamento dello strumento e la domanda del DPS dell'ESPLORATORE di trattamento dell'informazione e sviluppo di metodo.

Spero che le nostre novità nella strumentazione e nel software facciano la piena capacità di FFF accessibile a più utenti.

Come usate l'ESPLORATORE per lo sviluppo di metodo?

CJ: L'ESPLORATORE ci aiuta a scegliere il giusto programma di flusso per raggiungere la separazione desiderata. Dobbiamo appena introdurre la geometria che del canale vogliamo e l'intervallo presupposto di dimensione delle particelle per i nostri campioni nell'ESPLORATORE, installiamo un programma nominale di flusso e subito ci darà un fractogram preveduto.

Il programma di flusso comprende la portata del canale e l'evoluzione della portata trasversale con tempo. I picchi previsti sono indicati immediatamente con i loro tempi di conservazione calcolati ed egualmente ci dà la diluizione di punta. Possiamo cambiare i parametri, quali le lunghezze di canale o le portate, per vedere che cosa l'effetto sarebbe. Ciò è tutto determinato rapidamente dal software, salvante ci considerevole tempo del laboratorio.

Nella nostra esperienza, le previsioni dell'ESPLORATORE sono molto accurate e molto attentamente seguono le tracce UV di esperimenti reali.

In questo modo, è diretta affinchè noi trovi un metodo che dà una risoluzione adatta. Una volta che abbiamo selezionato il metodo appropriato, possiamo esportarlo verso VOYAGER, che eseguiranno l'esperimento.

Come fa FFF contribuisce a capire la cinetica dell'aggregazione di un anticorpo? Che cosa sono le sfide quando analizza le droghe biologiche?

KRW: Le droghe convenzionali sono molecole in genere piccole formulate nelle capsule alle compresse che hanno una durata di prodotto in magazzino lunga. Al contrario, il biotherapeutics o le droghe biologiche è grandi molecole complesse che sono morfologicamente eterogenee.

È formulata in soluzione ed è amministrata dall'iniezione della siringa o dall'infusione endovenosa. Le sfide principali connesse con la loro analisi provengono dal fatto che tendono ad essere instabili e sensibili allo sforzo.

Per noi è quindi importante usare un trattamento analitico che non degrada o non denatura la droga biologica. Ci sono fasi di lavorazione multiple e fattori di sforzo che potrebbero piombo a denaturazione irreversibile, quali la temperatura, il pH e la composizione nella soluzione.

Se un monomero dell'anticorpo è denaturato, l'aggregazione e la precipitazione accadono, che diminuiranno la sua efficacia una volta iniettate in un paziente ed aumentano il suo potenziale per l'immunizzazione. È egualmente importante da distinguere fra questi cumuli della proteina ed agenti inquinanti non Xeros possibili, quali un microdroplet dell'olio siliconico, le bolle di aria, o persino i cocci di vetro o i frammenti della gomma.

Quali tecniche possono essere usate per la caratterizzazione dei cumuli della proteina?

KRW: La tecnica usata realmente dipende dalla dimensione della proteina. Ci sono parecchie tecniche per le proteine sopra un micrometro ma ci sono molto poche tecniche per analizzare le proteine nell'ordine dei nanometri fino a un micrometro.

la cromatografia di Dimensione-esclusione (SEC) è corrente il metodo più comunemente usato esaminare i cumuli della proteina, ma non è ideale. In primo luogo, la composizione in fase mobile è limitata e questa minimizza la diminuzione di assorbimento sulle superfici dell'imballaggio di colonna. Secondariamente, il poro disponibile gradua il limite secondo la misura l'intervallo delle dimensioni che ogni colonna può separare.

In terzo luogo, la colonna a riempimento causerà la degradazione della tosatura, che è particolarmente problematica quando i cumuli transitori stanno studiandi. Per concludere, evitare la colonna che tappa, i campioni sono filtrati solitamente o ultracentrifugato e non c'è conoscenza di precisamente che cosa è eliminato durante questo trattamento.

Abbiamo messo a punto un metodo semplice basato su asimmetrico-flusso FFF (AF4) congiuntamente allo scattering leggero per rispondere al fabbisogno di informazioni su che cosa è perso in sec: più grandi cumuli o quelli che subiscono la tosatura sulla colonna. Ci permette di ottenere le informazioni sui cumuli della proteina di submicron.

Potete dirci di più circa i vantaggi di questa metodologia?

KRW: il Asimmetrico-flusso FFF comprende la separazione di componenti in un canale aperto, facendo uso di nessun materiale da imballaggio. Un campo è perpendicolare applicato all'asse della separazione per formare il flusso incrociato. L'uso di un canale aperto permette di realizzare le separazioni attraverso un vasto intervallo di grandezza, misurante da un nanometro fino ai dieci dei micrometri. Tuttavia, troviamo che esegue il più bene per le macromolecole nell'ordine di 104 a più maggior di 108 Daltons.

C'è molta flessibilità per quanto riguarda la scelta del liquido dei portafili poichè ci sono meno interazioni con la superficie della separazione.

Inoltre, lo troviamo utile potere sintonizzare facilmente le separazioni regolando la tariffa del flusso incrociato, che a sua volta cambia l'intensità di campo e poi egualmente il tempo di conservazione.

AF4 presenta i vantaggi sopra la cromatografia di dimensione-esclusione quando analizza i più grandi analiti di 100 nanometri e sopra, che comprende i cumuli dell'anticorpo.

Così come questo combinato con indicatore luminoso sta spargendo la tecnologia?

KRW: Il tempo di conservazione in AF4 può essere collegato con un coefficiente di diffusione di traduzione che può a loro volta essere collegato con un raggio idrodinamico facendo uso dell'equazione di Rifornire-Einstein. In pratica, AF4 raggiunge la separazione basata sulla dimensione idrodinamica.

Una volta che i campioni dimensione-sono stati separati da AF4 sono esposti ad un rivelatore online di luminoso scattering. Se un rivelatore di luminoso scattering (MALS) di multi-angolo è usato, le misure del raggio molare di media dei quadrati della root e della massa possono essere ottenute. Se un rivelatore dinamico (DLS) di luminoso scattering è usato, il coefficiente di diffusione di traduzione può essere misurato da cui il raggio idrodinamico può essere calcolato facendo uso del rifornisce l'equazione di Einstein.

AF4 e lo scattering leggero sono tecniche complementari con le capacità sinergiche importanti. AF4 può prelevare un campione eterogeneo e polidisperso e separarlo nelle frazioni mono-disperse. MALLES VENOSTA e DLS poi forniscono una misura ortogonale della massa molare e graduano. Questi valori possono essere confrontati ai valori AF4 calcolati facendo uso della teoria AF4.

Come può AF4 MALLES VENOSTA essere usato per studiare la cinetica dell'aggregazione della proteina?

KRW: Ci sono quattro fasi di base alla formazione di cumulo della proteina. La fase 1 è l'associazione parziale del reversibile e di spiegamento con un altro monomero reattivo; La fase 2 è formazione aggregata irreversibile del nucleo; La fase 3 è polimerizzazione a catena; e la fase 4 è condensazione aggregata. Il risultato finale è la formazione delle specie solubili di submicron della massa del alto-molare, che è che cosa stiamo provando a caratterizzare

Il modello nucleato dell'aggregazione (LENP) di polimerizzazione di Lumry-Eyring fornisce una descrizione quantitativa più completa della cinetica non indigena dell'aggregazione che i modelli precedenti mentre comprende tutte queste fasi differenti. Il modello di LENP valuta tre scale cronologiche differenti: il momento per nucleazione (t)n; i tempi per polimerizzazione del cambiamento (t)g; ed il momento per condensazione aggregata (t)c.

Facendo uso di una serie di equazioni differenziali, la tn, la tg e la tc possono essere risolute se la frazione del monomero e la massa molare dei cumuli possono essere risolute in funzione di tempo. E questo può essere raggiunto con AF4 e MALLES VENOSTA.

Quando abbiamo applicato la tecnica ad un campione di IgG1 anti--streptavidin, abbiamo veduto due picchi. Il primo picco si è presentato a sette e ad una metà di minuti e questo era per un monomero di 150 kilodalton (che corrisponde alla massa molare per IgG1 anti--streptavidin). Il secondo picco, che abbiamo veduto dopo circa nove minuti, era per i cumuli. Quindi, siamo riuscito a separare i monomeri ed i cumuli.

Il video della dimensione di questi picchi ci ha permesso di studiare gli effetti dello sforzo, quale il calore, sulla proteina che è riflessa. Senza il calore c'era soltanto un picco per il monomero di 150 kilodalton. Mentre il calore era applicato, abbiamo veduto che il picco aggregato sembrare e sono aumentato col passare del tempo di dimensione come più della proteina è stato denaturato tramite l'esposizione al calore. La dimensione del picco del monomero poi è stata tracciata in funzione di tempo di sforzo. I punti di informazioni da AF4-MALS hanno mostrato la perdita aumentante del monomero come il tempo di sforzo aumenta. Dalla riga di misura, potremmo poi determinare i valori per la tn, la tc ed il T.g

In questo modo, facendo uso delle analisi di MALLES VENOSTA e di AF4, abbiamo indicato che campioni di centrifugazione, una pratica comune prima di cromatografia di dimensione-esclusione, cambiamenti le scale cronologiche per ciascuno dei punti: il punto di nucleazione, il punto di polimerizzazione a catena ed il punto aggregato di condensazione. Nel caso di IgG1 anti--streptavidin, il cambiamento non era abbastanza grande cambiare la cinetica dell'aggregazione.

Che cosa è l'effetto della separazione AF4 sui cumuli della proteina?

KRW: Abbiamo valutato la stabilità dei cumuli della proteina facendo uso di FFF dopo la sollecitazione termica e dopo l'aggiunta di acido citrico. Potremmo seguire col passare del tempo le dimensioni dei cambiamenti al campione.

Abbiamo trovato che il punto di messa a fuoco AF4 non ha creato i cumuli anti--streptavidin IgG1. La composizione liquida nei portafili, tuttavia, ha pregiudicato la stabilità aggregata e l'associazione aggregata tesa per accadere durante la diluizione.

La diluizione in AF4 si presenta pricipalmente allo sbocco del canale e non durante il trattamento della separazione. Ciò può fornire una situazione di perdono per la separazione degli analiti concentrazione sensibili che la cromatografia di dimensione-esclusione.

Come AF4 e la cromatografia MALLES VENOSTA di dimensione-esclusione confrontano per gli studi dell'aggregazione della proteina?

La cromatografia di Dimensione-esclusione del KRW e AF4 sono a tecniche di separazione basate a dimensione complementari. la cromatografia di Dimensione-esclusione ha migliore risoluzione per i piccoli oligomeri, mentre AF4 è migliore per analizzare i cumuli di massa molari più di ordine alto, particolarmente quelli che sono a resistenza di taglio incline.

Gli studi cinetici qualitativi indicano che AF4 può anche andare su ai cumuli di 20 micrometri, che è un intervallo di grandezza non possibile con la cromatografia di dimensione-esclusione.

Crediamo che AF4 MALLES VENOSTA possa dare le comprensioni importanti nei meccanismi cinetici e permettere agli studi sulla stabilità dei cumuli.

Dove possono i nostri lettori andare scoprire più?

Per scoprire di più vogliate per visualizzare il https://www.wyatt.com/library/webinars/probing-submicron-protein-aggregation-using-asymmetrical-flow-field-flow-fractionation-af4-and-light-scattering.html & www.wyatt.com/Eclipse

Circa Kim R Williams

Kim R Williams è professore di chimica al banco di Colorado delle miniere che hanno condotto il suo lavoro post-dottorato con l'inventore del frazionamento di Campo-Flusso, il professor recente J. Calvin Giddings. La ricerca del Dott. Williams include i fondamenti d'avanzamento di FFF e FFF di sviluppo con lo scattering leggero come una piattaforma per separare e caratterizzare simultaneamente i polimeri complessi, le proteine, le installazioni molecolari eccellenti ed i sistemi di nanoparticella.

Dott. Christoph Johann

Il Dott. Christoph Johann è Product Manager globale per i prodotti di eclipse FFF alla tecnologia di Wyatt. È stato attivo nell'analisi del biopolimero e del polimero per oltre 30 anni ed ha fondato la consociata europea principale della tecnologia di Wyatt. Il Dott. Johann è stato coinvolgere nello sviluppo di strumentazione dell'eclipse FFF di Wyatt.

 

 

 

 

 

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    Wyatt Technology. (2019, March 27). Aggregazione di sondaggio della proteina di submicron facendo uso del frazionamento asimmetrico di Campo-Flusso di flusso, di AF4 e dello scattering leggero. News-Medical. Retrieved on October 18, 2019 from https://www.news-medical.net/news/20190327/Probing-Submicron-Protein-Aggregation-using-Asymmetrical-Flow-Field-Flow-Fractionation-AF4-and-Light-Scattering.aspx.

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