Agregação submicrónica de sondagem da proteína usando o fraccionamento assimétrico do Campo-Fluxo do fluxo, o AF4, e a dispersão de luz


insights from industryKim R Williams
Dr. Christoph Johann

Wyatt Technology

A instrumentação da dispersão de luz é amplamente utilizada na caracterização dos macroparticles e dos nanoparticles na solução. Fornece ferramentas do de ponta para determinar a massa, o tamanho, a conformação, a carga, e interacções absolutos do molar usando a dispersão de luz do multi-ângulo (MALS), o viscometry diferencial, o fraccionamento do campo-fluxo (FFF), a dispersão de luz dinâmica (DLS), a mobilidade electrophoretic e os inclinações de composição.

As revelações as mais recentes por Wyatt em seus instrumentação e software fizeram a capacidade plena de FFF acessível a uma base de utilizadores mais larga. Nesta entrevista, Kim R. Williams e Christoph Johann falam a Notícia-Médico e às ciências da vida sobre as tecnologias e sua pesquisa.

Que são as características as mais proeminentes de FFF? Por que devemos nós usar FFF?

CJ: Primeiramente, nós devemos rever as características as mais proeminentes de FFF. FFF separa fisicamente amostras de acordo com o tamanho, conseqüentemente permite que nós recolham fracções. Com o sistema do eclipse FFF nós podemos separar entidades somente de alguns nanômetros até micrômetros em tamanho. Além disso, a técnica é delicada, exercendo baixas forças de tesoura, e não-destrutivo.

FFF é particularmente poderoso quando usado conjuntamente com MALS, que fornece a massa do molar e o tamanho absolutos de fracções eluted. Porque combina a separação tamanho-baseada com a dispersão de luz em linha, tem mais de alta resolução o grupo do que padrão, ou unfractionated, DLS.

Também, eu penso o software novo do DPS do ESCUTEIRO que a revelação autónoma do método dos apoios é uma característica adicional emocionante. Este software minimiza o número de experiências exigidas para a revelação do método. Eu posso obter um resultado óptimo com apenas algumas injecções um pouco do que passando horas no laboratório.

Que tipo de dados é obtido das experiências de FFF?

CJ: Nós podemos obter distribuições detalhadas da massa absoluta do molar e do raio do RMS das análises da dispersão de luz do multi-ângulo em cada volume de eluição. Além, nós podemos calcular o raio hidrodinâmico em cada volume de eluição da dispersão de luz dinâmica ou derivá-lo do tempo de retenção de FFF.

Para macromoléculas a concentração está derivada de um detector UV ou do R.I. a fim obter distribuições quantitativas, quando para nanoparticles a distribuição da concentração da partícula for determinada da dispersão de luz apenas.

Como você se assegura de que as proteínas não interajam com a membrana AF4?

KRW: É importante verificar particularmente que não há nenhuma interacção entre a proteína e a membrana usadas em AF4, quando AF4 está sendo usado para calcular o tamanho de partícula dos tempos de retenção.

Eu penso que é sempre sábio fazer uma corrida inicial sem o cruzamento de fluxos, para se assegurar de que bastante amostra esteja injectada e um pico muito grande esteja obtido nos detectores. Se você se encontra na situação drástica da perda completa da amostra, você pode poder retificá-la diminuindo a força de campo ou a taxa do cruzamento de fluxos.

As interacções podem igualmente ser reduzidas precondicionando a membrana, por exemplo injetando uma solução da proteína, ou reduzindo a carga de sal. Eu encontro que uma solução de cloreto de sódio 50 millimolar, ou mesmo de amortecedor de fosfato sem o sal adicionado de todo, melhora a definição e a recuperação em FFF. Você não tem que sempre usar amortecedores de PBS com o cloreto de sódio 150 millimolar como é comum na cromatografia MALS da tamanho-exclusão.

Pode você descrever o eclipse FFF?

CJ: Eu penso que a coisa a mais importante é que o eclipse FFF é fácil de usar, enquanto sendo um sistema poderoso e robusto. Combina três características chaves:  integração sem emenda; automatização completa do sistema completo e das capacidades de processo de dados extensivas.

É grande poder integrar os trabalhos completos da revelação do método ao resultado final usando a plataforma de software nova da VISÃO CSH. Isto inclui o pedido dos CD do EXPLORADOR para experiências do controle e do corredor do instrumento e o pedido do DPS do ESCUTEIRO para a revelação do processo de dados e do método.

Eu espero que nossas novidades na instrumentação e no software farão a capacidade plena de FFF acessível a mais usuários.

Como você usa o ESCUTEIRO para a revelação do método?

CJ: O ESCUTEIRO ajuda-nos a escolher o programa direito do fluxo conseguir a separação desejada. Nós apenas precisamos de entrar a geometria que do canal nós queremos e a escala supor do tamanho de partícula para nossas amostras no ESCUTEIRO, estabelecemos um programa e um straightaway nominais do fluxo nos dará um fractogram previsto.

O programa do fluxo inclui o caudal do canal e a evolução do caudal transversal com tempo. Os picos previstos são mostrados imediatamente com seus tempos de retenção calculados, e igualmente dá-nos a diluição máxima. Nós podemos mudar parâmetros, tais como comprimentos de canal ou caudais, para ver o que o efeito seria. Este é todo o determinado rapidamente pelo software, salvar nos tempo considerável do laboratório.

Em nossa experiência, as previsões do ESCUTEIRO são muito exactas e seguem pròxima os traços UV de experiências reais.

Desta maneira, é directa para que nós encontrem um método que dê uma definição apropriada. Uma vez que nós seleccionamos o método apropriado, nós podemos exportá-lo para o EXPLORADOR, que executará a experiência.

Como faz FFF ajuda a compreender a cinética da agregação de um anticorpo? Que são os desafios ao analisar drogas biológicas?

KRW: As drogas convencionais são moléculas tipicamente pequenas formuladas em cápsulas às tabuletas que têm uma vida útil longa. Ao contrário, o biotherapeutics ou as drogas biológicas são as grandes moléculas complexas que são morfològica heterogêneas.

São formulados na solução e administrados pela injecção da seringa ou pela infusão intravenosa. Os desafios do cano principal associaram com sua haste da análise do facto de que tendem a ser instáveis e sensíveis ao esforço.

É conseqüentemente importante para nós usar um processo analítico que não degrade nem não desnature a droga biológica. Há as etapas de processamento múltiplo e os factores de força que poderiam conduzir à desnaturação irreversível, tal como a temperatura, o pH, e a composição da solução.

Se um monómero do anticorpo é desnaturado, a agregação e a precipitação ocorrem, que reduzirão sua eficácia quando injetadas em um paciente e aumentam seu potencial para a imunogenicidade. É igualmente importante distinguir entre estes agregados da proteína e contaminadores estrangeiros possíveis, tais como um microdroplet do petróleo de silicone, umas bolhas de ar, ou mesmo uns fragmentos de vidro do estilhaço ou os de borracha.

Que técnicas podem ser usadas caracterizando agregados da proteína?

KRW: A técnica usada depende realmente do tamanho da proteína. Há diversas técnicas para proteínas acima de um micrômetro mas há muito poucas técnicas para analisar proteínas na escala dos nanômetros até um micrômetro.

a cromatografia da Tamanho-exclusão (SEC) é actualmente o método o mais de uso geral para olhar agregados da proteína, mas não é ideal. Antes de mais nada, a composição da fase móvel é limitada, e esta minimiza a mitigação da absorção nas superfícies da embalagem de coluna. Em segundo lugar, o poro disponível faz sob medida o limite a escala dos tamanhos que cada coluna pode separar.

Em terceiro lugar, a coluna embalada causará a degradação da tesoura, que é especialmente problemática quando os agregados transientes estão sendo estudados. Finalmente, para evitar a coluna que obstrui, as amostras são filtradas geralmente ou ultra-centrifugado e não há nenhum conhecimento de precisamente o que é removido durante este processo.

Nós desenvolvemos um método simples baseado no assimétrico-fluxo FFF (AF4) em combinação com a dispersão de luz para endereçar a necessidade para obter informações sobre do que é perdido no segundo: agregados maiores ou aqueles que se submetem à tesoura na coluna. Permite-nos de obter a informação em agregados submicrónicos da proteína.

Pode você dizer-nos mais sobre as vantagens desta metodologia?

KRW: o Assimétrico-fluxo FFF envolve a separação de componentes em um canal aberto, não usando nenhum material de embalagem. Um campo é perpendicular aplicada à linha central da separação para formar o cruzamento de fluxos. O uso de um canal aberto torna possível executar separações através de uma escala larga do tamanho, medindo de um nanômetro até dez dos micrômetros. Contudo, nós encontramos que executa melhor para macromoléculas na escala de 104 a maior de 108 Daltons.

Há muita flexibilidade em relação à escolha do líquido do portador porque há menos interacções com a superfície da separação.

Além, nós encontramos útil poder ajustar facilmente as separações ajustando a taxa do cruzamento de fluxos, que muda por sua vez a força de campo e então igualmente o tempo de retenção.

AF4 tem vantagens sobre a cromatografia da tamanho-exclusão ao analisar analytes maiores de 100 nanômetros e acima, que inclui agregados do anticorpo.

Assim como é esta combinada com a dispersão de luz tecnologia?

KRW: O tempo de retenção em AF4 pode ser relacionado a um coeficiente de difusão translational que possa por sua vez ser relacionado a um raio hidrodinâmico usando a equação de Avivar-Einstein. Essencialmente, AF4 consegue a separação baseada no tamanho hidrodinâmico.

Uma vez que as amostras tamanho-foram separadas por AF4 estão expor a um detector em linha da luz-dispersão. Se um detector da luz-dispersão (MALS) do multi-ângulo é, medidas da massa do molar e do meio da raiz - o raio quadrado podido ser obtido. Se um detector dinâmico (DLS) da luz-dispersão é usado, o coeficiente de difusão translational pode ser medido de que o raio hidrodinâmico pode ser utilização calculada aviva a equação de Einstein.

AF4 e a dispersão de luz são técnicas complementares com capacidades sinérgicos importantes. AF4 pode tomar uma amostra heterogênea, polydisperse e separá-la em fracções mono-dispersadas. MALS e DLS então fornecem uma medida ortogonal da massa do molar e fazem-na sob medida. Estes valores podem ser comparados a AF4 avaliam calculado usando a teoria AF4.

Como pode AF4 MALS ser usado para estudar a cinética da agregação da proteína?

KRW: Há quatro fases básicas à formação de um agregado da proteína. A fase 1 é a revelação parcial e a associação reversível com um outro monómero reactivo; A fase 2 é formação agregada irreversível do núcleo; A fase 3 é polimerização chain; e a fase 4 é condensação agregada. O resultado final é a formação da espécie submicrónica da massa solúvel do alto-molar, que é o que nós estamos tentando caracterizar

O modelo Nucleated da agregação (LENP) da polimerização de Lumry-Eyring fornece uma descrição quantitativa mais detalhada da cinética não-nativa da agregação do que modelos precedentes enquanto abrange todas estas fases diferentes. O modelo de LENP avalia três calendários diferentes: o momento para a nucleação (t)n; os tempos para a polimerização da mudança (t)g; e o momento para a condensação agregada (t)c.

Usando uma série de equações diferenciais, tn, tg e tc podem ser determinados se a fracção do monómero e a massa do molar dos agregados podem ser determinadas em função do tempo. E isto pode ser conseguido com AF4 e MALS.

Quando nós aplicamos a técnica a uma amostra de anti-streptavidin IgG1, nós vimos dois picos. O primeiro pico ocorreu em sete e em uma metade das actas, e este era para um monómero de 150 kilodalton (que corresponde à massa do molar para anti-streptavidin IgG1). O segundo pico, que nós vimos após aproximadamente nove minutos, era para os agregados. Assim, nós controlamos separar monómeros e agregados.

Monitorar o tamanho destes picos permitiu-nos de estudar os efeitos do esforço, tais como o calor, na proteína que está sendo monitorada. Sem o calor havia somente um pico para o monómero de 150 kilodalton. Enquanto o calor era aplicado, nós vimos que o pico agregado para parecer e aumentaram em tamanho ao longo do tempo como mais da proteína foi desnaturado pela exposição ao calor. O tamanho do pico do monómero foi traçado então em função do tempo do esforço. Os pontos de dados de AF4-MALS mostraram a perda crescente do monómero como o tempo do esforço aumenta. Da linha de ajuste, nós poderíamos então determinar valores para tn, tc e T.g

Desta maneira, usando análises de AF4 e de MALS, nós mostramos que as amostras de centrifugação, uma prática comum antes da cromatografia da tamanho-exclusão, mudanças os calendários para cada um das etapas: a etapa da nucleação, a etapa da polimerização chain, e a etapa agregada da condensação. No caso de anti-streptavidin IgG1, a mudança não era grande bastante mudar a cinética da agregação.

Que é o efeito da separação AF4 em agregados da proteína?

KRW: Nós avaliamos a estabilidade de agregados da proteína usando FFF após o esforço de calor e após a adição de ácido cítrico. Nós poderíamos seguir a extensão das mudanças à amostra ao longo do tempo.

Nós encontramos que a etapa AF4 de focalização não criou os anti-streptavidin agregados IgG1. A composição líquida do portador, contudo, afectou a estabilidade agregada, e a associação agregada tendida a ocorrer durante a diluição.

A diluição em AF4 ocorre principalmente na tomada do canal e não durante o processo da separação. Isto pode fornecer uma situação de perdão para separar analytes concentração-sensíveis do que a cromatografia da tamanho-exclusão.

Como AF4 e a cromatografia MALS da tamanho-exclusão comparam para estudos da agregação da proteína?

A cromatografia da Tamanho-exclusão do KRW e AF4 são técnicas de separação tamanho-baseadas complementares. a cromatografia da Tamanho-exclusão tem a melhor definição para oligómero pequenos, visto que AF4 é melhor para analisar os agregados de ordem superior da massa do molar, especialmente aqueles que são esforço de tesoura inclinado.

Os estudos cinéticos qualitativos mostram que AF4 pode mesmo ir acima aos agregados de 20 micrômetros, que é uma escala do tamanho nao possível com cromatografia da tamanho-exclusão.

Nós acreditamos que AF4 MALS pode dar introspecções importantes em mecanismos cinéticos e permitir estudos da estabilidade dos agregados.

Onde podem nossos leitores ir encontrar mais?

Para encontrar satisfaça mais para visitar o https://www.wyatt.com/library/webinars/probing-submicron-protein-aggregation-using-asymmetrical-flow-field-flow-fractionation-af4-and-light-scattering.html & o www.wyatt.com/Eclipse

Sobre Kim R Williams

Kim R Williams é professor da química na escola de Colorado das minas que conduziram seu trabalho doutoral do cargo com o inventor do fraccionamento do Campo-Fluxo, professor atrasado J. Calvin Giddings. A pesquisa do Dr. Williams inclui fundamentos de avanço de FFF e FFF tornando-se com dispersão de luz como uma plataforma para separar e caracterizar simultaneamente polímeros complexos, proteínas, os conjuntos moleculars super e os sistemas do nanoparticle.

Dr. Christoph Johann

O Dr. Christoph Johann é o Director de produto global para produtos do eclipse FFF na tecnologia de Wyatt. Foi activo na análise do polímero e do biopolymer por mais de 30 anos e fundou a subsidiária européia principal da tecnologia de Wyatt. O Dr. Johann foi envolvido na revelação da instrumentação do eclipse FFF de Wyatt.

 

 

 

 

 

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    Wyatt Technology. (2019, March 27). Agregação submicrónica de sondagem da proteína usando o fraccionamento assimétrico do Campo-Fluxo do fluxo, o AF4, e a dispersão de luz. News-Medical. Retrieved on October 16, 2019 from https://www.news-medical.net/news/20190327/Probing-Submicron-Protein-Aggregation-using-Asymmetrical-Flow-Field-Flow-Fractionation-AF4-and-Light-Scattering.aspx.

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    Wyatt Technology. 2019. Agregação submicrónica de sondagem da proteína usando o fraccionamento assimétrico do Campo-Fluxo do fluxo, o AF4, e a dispersão de luz. News-Medical, viewed 16 October 2019, https://www.news-medical.net/news/20190327/Probing-Submicron-Protein-Aggregation-using-Asymmetrical-Flow-Field-Flow-Fractionation-AF4-and-Light-Scattering.aspx.