Agregación de sondeo de la proteína del submicron usando el fraccionamiento asimétrico del Campo-Flujo del flujo, AF4, y la dispersión luminosa


insights from industryKim R Williams
Dr. Christoph Johann

Wyatt Technology

La instrumentación de la dispersión luminosa es ampliamente utilizada en la caracterización de macroparticles y de nanoparticles en la solución. Ofrece las herramientas del filo para determinar la masa, la talla, la conformación, la carga, y acciones recíprocas molares absolutas usando la dispersión luminosa del multi-ángulo (MALS), la viscometría diferenciada, el fraccionamiento del campo-flujo (FFF), la dispersión luminosa dinámica (DLS), la movilidad electroforética y gradientes de composición.

La mayoría de los recientes desarrollos de Wyatt en su instrumentación y software han hecho la capacidad máxima de FFF accesible a una base de usuarios más ancha. En esta entrevista, Kim R. Williams y Cristóbal Juan hablan con Noticia-Médico y las ciencias de la vida sobre las tecnologías y su investigación.

¿Cuáles son las características más prominentes de FFF? ¿Por qué debemos utilizar FFF?

CJ: Primero, debemos revisar las características más prominentes de FFF. FFF separa físicamente muestras según talla, por lo tanto permite que cerco fracciones. Con el sistema del eclipse FFF podemos separar entidades solamente de algunos nanómetros hasta micrómetros de tamaño. Además, la técnica es apacible, ejerciendo fuerzas de resistencia inferiores, y no destructivo.

FFF es determinado potente cuando está utilizado conjuntamente con MALS, que ofrece la masa y la talla molares absolutas de fracciones enjuagadas. Porque combina la separación talla-basada con la dispersión luminosa en línea, tiene más de alta resolución mezcla que estándar, o unfractionated, DLS.

También, pienso el nuevo software del DPS del EXPLORADOR que el revelado fuera de línea del método de los apoyos es una característica adicional emocionante. Este software disminuye el número de experimentos requeridos para el revelado del método. Puedo obtener un resultado óptimo con apenas algunas inyecciones bastante que pasando horas en el laboratorio.

¿Qué tipo de datos se obtiene de experimentos de FFF?

CJ: Podemos obtener distribuciones detalladas de la masa molar absoluta y del radio del RMS de los análisis de la dispersión luminosa del multi-ángulo en cada volumen de elución. Además, podemos calcular el radio hidrodinámico en cada volumen de elución de la dispersión luminosa dinámica o derivarlo a partir del tiempo de retención de FFF.

Para las macromoléculas la concentración se deriva de un detector ULTRAVIOLETA o del índice de refracción para obtener distribuciones cuantitativas, mientras que para los nanoparticles la distribución de la concentración de la partícula se cuantifica de la dispersión luminosa solamente.

¿Cómo usted se asegura de que las proteínas no obren recíprocamente con la membrana AF4?

KRW: Es importante verificar que no hay acciones recíprocas entre la proteína y la membrana usadas en AF4, determinado cuando AF4 se está utilizando para calcular talla de partícula a partir de tiempos de retención.

Pienso que es siempre sabio hacer una corrida inicial sin cruce de corrientes, para asegurarse de que se ha inyectado suficiente muestra y un pico muy grande está obtenido en los detectores. Si usted se encuentra en la situación drástica de la baja completa de la muestra, usted puede poder rectificarla disminuyendo la fuerza de campo o el régimen del cruce de corrientes.

Las acciones recíprocas pueden también ser reducidas precondicionando la membrana, por ejemplo inyectando una solución de la proteína, o reduciendo la carga de la sal. Encuentro que una solución del cloruro de sodio millimolar 50, o aún del almacenador intermedio de fosfato sin la sal adicional en absoluto, perfecciona la resolución y la recuperación en FFF. Usted no tiene que siempre utilizar almacenadores intermedios de PBS con el cloruro de sodio millimolar 150 al igual que común en cromatografía MALS de la talla-exclusión.

¿Puede usted describir el eclipse FFF?

CJ: Pienso que la cosa más importante es que el eclipse FFF es fácil de utilizar, mientras que siendo un sistema potente y robusto. Combina tres características dominantes:  integración sin fisuras; automatización completa del sistema completo y de las capacidades de proceso de datos extensas.

Es grande poder integrar el flujo de trabajo completo del revelado del método al resultado final usando la nueva plataforma de programación de VISION CSH. Esto incluye el uso de los CD del VIAJERO para los experimentos del mando y del funcionamiento del instrumento y el uso del DPS del EXPLORADOR para el revelado de la informática y del método.

Espero que nuestras novedades en la instrumentación y el software hagan la capacidad máxima de FFF accesible a más utilizadores.

¿Cómo usted utiliza al EXPLORADOR para el revelado del método?

CJ: El EXPLORADOR nos ayuda a elegir el programa correcto del flujo para lograr la separación deseada. Apenas necesitamos entrar la geometría del canal que queremos y la gama de tallas presunta de la partícula para nuestras muestras en EXPLORADOR, que fijamos un programa y un straightaway nominales del flujo nos dará un fractogram previsto.

El programa del flujo incluye el flujo del canal y la evolución del flujo cruzado con tiempo. Los picos previstos se muestran inmediatamente con sus tiempos de retención calculados, y también nos da la dilución máxima. Podemos cambiar parámetros, tales como largos de canal o flujos, para ver cuáles sería el efecto. Éste es todo el determinado rápidamente por el software, salvándonos considerable tiempo del laboratorio.

En nuestra experiencia, las predicciones del EXPLORADOR son muy exactas y siguen de cerca los trazos ULTRAVIOLETA de experimentos reales.

De esta manera, es directa para que encontremos un método que dé una resolución conveniente. Una vez que hemos seleccionado el método apropiado, podemos exportarlo al VIAJERO, que ejecutará el experimento.

¿Cómo hace FFF ayuda a entender la cinética de la agregación de un anticuerpo? ¿Cuáles son los retos al analizar las drogas biológicas?

KRW: Las drogas convencionales son moléculas típicamente pequeñas formuladas en cápsulas a las tablillas que tienen una vida útil larga. En cambio, el biotherapeutics o las drogas biológicas es las moléculas complejas grandes que son morfológicamente heterogéneas.

Él se formula en la solución y es administrado por la inyección de la jeringa o la infusión intravenosa. Los retos principales asociados a su análisis provienen el hecho de que tienden a ser inestables y sensibles a la tensión.

Es por lo tanto importante que utilicemos un proceso analítico que no degrade ni desnaturalice la droga biológica. Hay las fases de tratamiento múltiple y los factores de ansiedad que podrían llevar a la desnaturalización irreversible, tal como temperatura, pH, y composición de la solución.

Si se desnaturaliza un monómero del anticuerpo, la agregación y la precipitación ocurren, que reducirán su eficacia cuando están inyectadas en un paciente y aumentan su potencial para la inmunogeneticidad. Es también importante distinguir entre estos agregados de la proteína y contaminantes no nativos posibles, tales como un microdroplet del aceite de silicón, burbujas de aire, o aún fragmentos de cristal del casco o de goma.

¿Qué técnicas se pueden utilizar para caracterizar los agregados de la proteína?

KRW: La técnica usada depende realmente de la talla de la proteína. Hay varias técnicas para las proteínas encima de un micrómetro pero hay muy pocas técnicas para analizar las proteínas en el rango de nanómetros hasta un micrómetro.

la cromatografía de la Talla-exclusión (SEC) es actualmente el método más de uso general observar los agregados de la proteína, pero no es ideal. En primer lugar, la composición de la fase movible es limitada, y ésta disminuye la mitigación de la amortiguación en las superficies del empaque de olumna. En segundo lugar, el poro disponible clasifica límite el alcance de las tallas que cada olumna puede separar.

En tercer lugar, la olumna cargada causará la degradación de la resistencia, que es especialmente problemática cuando se están estudiando los agregados transitorios. Finalmente, evitar la olumna que tapa, las muestras se filtran generalmente o ultracentrifugado y no hay conocimiento de exacto qué se quita durante este proceso.

Desarrollamos un método simple basado en el asimétrico-flujo FFF (AF4) conjuntamente con la dispersión luminosa para dirigir la necesidad de la información sobre qué se pierde en el SEC: agregados más grandes o los que experimentan resistencia en la olumna. Nos permite obtener la información sobre los agregados de la proteína del submicron.

¿Puede usted informarnos más sobre las ventajas de esta metodología?

KRW: el Asimétrico-flujo FFF implica la separación de componentes en un canal abierto, usando ningún material de embalaje. Un campo es perpendicular aplicada al eje de la separación para formar el cruce de corrientes. El uso de un canal abierto permite realizar separaciones a través de una gama de tallas amplia, atravesando a partir de un nanómetro hasta diez de micrómetros. Sin embargo, encontramos que se realiza mejor para las macromoléculas en el rango de 104 a mayor de 108 Daltons.

Hay mucha adaptabilidad con respecto a la opción del líquido de la onda portadora pues hay menos acciones recíprocas con la superficie de la separación.

Además, encontramos útil poder sintonizar fácilmente las separaciones ajustando el régimen del cruce de corrientes, que a su vez cambia la fuerza de campo y entonces también el tiempo de retención.

AF4 tiene ventajas sobre la cromatografía de la talla-exclusión al analizar analitos más grandes de 100 nanómetros y arriba, que incluye los agregados del anticuerpo.

¿Tan cómo es ésta combinada con la dispersión luminosa tecnología?

KRW: El tiempo de retención en AF4 se puede relacionar con un coeficiente de difusión de translación que se pueda a su vez relacionar con un radio hidrodinámico usando la ecuación de Alimentar-Einstein. Esencialmente, AF4 logra la separación basada en talla hidrodinámica.

Una vez que las muestras talla-han sido separadas por AF4 se exponen a un detector en línea el luz-dispersar. Si se utiliza un detector (MALS) el luz-dispersar del multi-ángulo, las mediciones del radio molar de la media cuadrada de la masa y de la raíz pueden ser obtenidas. Si se utiliza un detector (DLS) dinámico el luz-dispersar, el coeficiente de difusión de translación puede ser medido del cual el radio hidrodinámico se puede calcular usando alimenta la ecuación de Einstein.

AF4 y la dispersión luminosa son técnicas complementarias con capacidades sinérgicas importantes. AF4 puede recoger una muestra heterogénea, polidispersa y separarla en fracciones mono-dispersas. MALS y DLS después ofrecen una medición ortogonal de la masa molar y la clasifican. Estos valores se pueden comparar a los valores AF4 calculados usando la teoría AF4.

¿Cómo se puede AF4 MALS utilizar para estudiar la cinética de la agregación de la proteína?

KRW: Hay cuatro escenarios básicos a la formación de un agregado de la proteína. El escenario 1 es el despliegue parcial y la asociación reversible con otro monómero reactivo; El escenario 2 es formación global irreversible del núcleo; El escenario 3 es polimerización de cadena; y el escenario 4 es condensación global. El resultado final es la formación de la especie soluble del submicron de la masa de la alto-muela, que es lo que estamos intentando caracterizar

El modelo Nucleated de la agregación (LENP) de la polimerización de Lumry-Eyring ofrece una descripción cuantitativa más completa de la cinética extranjera de la agregación que modelos anteriores mientras que abarca todos estos diversos escenarios. El modelo de LENP fija tres diversos calendarios: la época para la nucleación (t)n; los tiempos para la polimerización del cambio (t)g; y la época para la condensación global (t)c.

Usando una serie de ecuaciones diferenciales, tn, tg y tc pueden ser resueltos si la fracción del monómero y la masa molar de los agregados pueden ser resueltas en función de tiempo. Y esto se puede lograr con AF4 y MALS.

Cuando aplicamos la técnica a una muestra de IgG1 anti-streptavidin, vimos dos picos. El primer pico ocurrió en siete y una mitad de los minutos, y éste estaba para un monómero de 150 kilodalton (que corresponde a la masa molar para IgG1 anti-streptavidin). El segundo pico, que vimos después de cerca de nueve minutos, estaba para los agregados. Así, manejamos separar los monómeros y los agregados.

Vigilar la talla de estos picos nos permitió estudiar los efectos de la tensión, tales como calor, sobre la proteína que era vigilada. Sin calor había solamente un pico para el monómero de 150 kilodalton. Mientras que el calor era aplicado, vimos que el pico global aparecer y él aumentaron de tamaño en un cierto plazo como más de la proteína fue desnaturalizada por la exposición al calor. La talla del pico del monómero entonces fue trazada en función de tiempo de la tensión. Los puntos de referencias de AF4-MALS mostraron baja cada vez mayor del monómero como el tiempo de la tensión aumenta. De la línea del ajuste, podríamos entonces determinar los valores para tn, tc y el T.g

De esta manera, usando análisis de AF4 y de MALS, hemos mostrado que las muestras de centrifugación, una práctica común antes de la cromatografía de la talla-exclusión, cambios los calendarios para cada uno de los pasos: el paso de la nucleación, el paso de la polimerización de cadena, y el paso global de la condensación. En el caso de IgG1 anti-streptavidin, el cambio no era bastante grande cambiar la cinética de la agregación.

¿Cuál es el efecto de la separación AF4 sobre los agregados de la proteína?

KRW: Fijamos la estabilidad de los agregados de la proteína usando FFF después de estrés térmico y después de la adición del ácido cítrico. Podríamos seguir el fragmento de cambios a la muestra en un cierto plazo.

Encontramos que el paso de enfoque AF4 no creó los agregados antis-streptavidin IgG1. La composición líquida de la onda portadora, sin embargo, afectó a estabilidad global, y a la asociación global tendida para ocurrir durante la dilución.

La dilución en AF4 ocurre principal en el enchufe del canal y no durante el proceso de la separación. Esto puede ofrecer una situación de perdón para separar los analitos concentración-sensibles que la cromatografía de la talla-exclusión.

¿Cómo AF4 y la cromatografía MALS de la talla-exclusión comparan para los estudios de la agregación de la proteína?

La cromatografía de la Talla-exclusión del KRW y AF4 son técnicas de separación talla-basadas complementarias. la cromatografía de la Talla-exclusión tiene mejor resolución para los pequeños oligómeros, mientras que AF4 es mejor para analizar los agregados en masa molares más de categoría alta, especialmente los que sean tensión de resistencia propensa.

Los estudios cinéticos cualitativos muestran que AF4 puede incluso subir a los agregados de 20 micrómetros, que es una gama de tallas no posible con cromatografía de la talla-exclusión.

Creemos que AF4 MALS puede dar discernimientos importantes en mecanismos cinéticos y habilitar estudios de la estabilidad de los agregados.

¿Dónde pueden nuestros programas de lectura ir a descubrir más?

Para descubrir satisfaga más para visitar https://www.wyatt.com/library/webinars/probing-submicron-protein-aggregation-using-asymmetrical-flow-field-flow-fractionation-af4-and-light-scattering.html y www.wyatt.com/Eclipse

Sobre Kim R Williams

Kim R Williams es profesor de la química en la escuela de Colorado de las minas que conducto su trabajo doctoral del poste con el inventor del fraccionamiento del Campo-Flujo, el último profesor J. Calvin Giddings. La investigación del Dr. Williams incluye fundamentales de avance de FFF y FFF que se convierte con la dispersión luminosa como una plataforma para separar y para caracterizar simultáneamente los polímeros complejos, las proteínas, los montajes moleculares estupendos y los sistemas del nanoparticle.

El Dr. Cristóbal Juan

El Dr. Cristóbal Juan es el Director de producto global para los productos del eclipse FFF en la tecnología de Wyatt. Él ha sido activo en el análisis del polímero y del biopolímero por más de 30 años y fundó el filial europeo principal de la tecnología de Wyatt. El Dr. Juan estuvo implicado en el revelado de la instrumentación del eclipse FFF de Wyatt.

 

 

 

 

 

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    Wyatt Technology. (2019, March 27). Agregación de sondeo de la proteína del submicron usando el fraccionamiento asimétrico del Campo-Flujo del flujo, AF4, y la dispersión luminosa. News-Medical. Retrieved on October 15, 2019 from https://www.news-medical.net/news/20190327/Probing-Submicron-Protein-Aggregation-using-Asymmetrical-Flow-Field-Flow-Fractionation-AF4-and-Light-Scattering.aspx.

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