Os biólogos moleculars desenvolvem o encanamento para criar e seleccionar peptides lantibiotic novos

A natureza forneceu-nos os lotes dos antimicrobianos. Contudo, dado o aumento rápido da resistência antimicrobial, há uma necessidade para a revelação de antibióticos da novo-à-natureza. Lantibiotics é uma opção interessante. Os biólogos moleculars da universidade de Groningen e de seus colegas em Suíça e de Alemanha têm desenvolvido agora um encanamento para criar e seleccionar um grande número peptides lantibiotic novos. Uma descrição do método e os primeiros resultados foram publicados o 1º de abril na biologia do produto químico da natureza do jornal.

Os peptides de Lantibiotic são alterados depois que são produzidos pelos ribosomes. As enzimas podem ligar ácidos aminados diferentes dentro da corrente do peptide para formar anéis. Um lantibiotic conhecido é a nisina, um peptide com cinco anéis que seja usado como um preservativo na indústria alimentar. “Há as seqüências de ácido aminado diferentes que compo os anéis,” explica a universidade do professor de Groningen da biologia molecular Oscar Kuipers. “Nós sabemos que uma selecção 12 do lantibiotics natural todos tem combinações diferentes.”

Genes sintéticos

Kuipers e seus colegas do ETH Zürich (Suíça) e universidade de Regensburg (Alemanha) planejaram um sistema para criar um grande número o lantibiotics novo: “Nós sintetizamos as costas do ADN que codificam para os anéis diferentes e combinamos estes módulos genéticos para formar os genes lantibiotic que codificam para combinações aleatórias de cinco anéis.” A biblioteca de gene que criaram conteve ao redor 14.000 genes sintéticos.

O passo seguinte era seleccionar os produtos do gene para o potencial antimicrobial. Para fazer este, alteraram uma técnica desenvolvida para a selecção da enzima, com base em grânulos do micro-alginate. Dentro destes grânulos - cada um ao redor 70 micrômetros no diâmetro - as bactérias podem crescer. Os genes da biblioteca foram postos em uma tensão do produtor, contendo um marcador fluorescente vermelho. “Nós diluímos estas bactérias de modo que nós terminássemos acima com uma ou zerássemos pilhas pelo grânulo. Nós igualmente adicionamos uma tensão do alvo que poderia ser matada pelo lantibiotics; aquelas pilhas foram usadas em uma concentração mais alta de ao redor 50 pelo grânulo.” As pilhas de alvo levaram um marcador fluorescente verde e produziram um peptidase que activasse o lantibiotics do precursor segregado pelas pilhas do produtor.

Exame

Quando os grânulos foram incubados, a tensão do produtor formou uma única colônia para dentro, segregando o lantibiotics. Estes peptides não podiam sair dos grânulos. O número de colônias verdes que crescem dentro de cada grânulo foi correlacionado negativamente com o efeito antimicrobial dos lanthipeptides ativados. Usando um classificador fluorescência-ajudado da pilha projetado para partículas, era possível seleccionar 50.000 grânulos pela hora e seleccionar grânulos com baixos níveis de fluorescência verde.

Mas esta selecção era de modo algum a extremidade do trabalho esse necessário a ser feito. O passo seguinte era isolar colônias do produtor dos grânulos selecionados que mostraram um efeito antimicrobial forte. Isto era directo; contudo, a caracterização exacta do produto formado despejou ser difícil devido aos baixos níveis da produção dentro do grânulo. “Nós primeiramente tivemos que crescê-los em quantidades maiores antes que nós poderíamos analisar o lantibiotic produzido.” Uma outra complicação era que as enzimas que produzem os anéis não trabalharam com precisão perfeita. “Mesmo em uma colônia, onde todas as pilhas têm o mesmo ADN, até cinco ou seis lanthipeptides diferentes poderiam ser produzidos.”

Projecto racional

Na extremidade, uma série de lanthipeptides com um efeito antimicrobial forte foi isolada e caracterizada. “Nós encontramos peptides com actividades antibióticas diferentes, embora diversos peptides olhassem um pouco como a nisina ou o epidermin. Despejou que nós tínhamos recreado mesmo a nisina em nossa biblioteca de gene.” A experiência forneceu muita informação sobre o relacionamento da estrutura-função dos anéis diferentes nos peptides lantibiotic. Isto pode agora ser usado para que uma aproximação racional do projecto crie antibióticos novos.

Uma segunda conclusão do estudo é que o encanamento - de produzir uma biblioteca de gene ao exame e à caracterização - trabalhos muito eficientemente. O passo seguinte é usar um micróbio patogénico real como uma tensão do repórter, em vez das pilhas de Lactococcus usadas no primeiro círculo. “E nós estamos trabalhando agora para criar peptides com o apenas um anel. Os peptides do cinco-anel que nós produzimos neste estudo são demasiado grandes para o uso farmacêutico. Muitos antibióticos assemelham-se a uma estrutura do um-anel, similar àquela do vancomycin.” Estes antibióticos são feitos pelo enlace enzimático específico dos ácidos aminados, visto que o lantibiotics é produzido dos genes pelos ribosomes. “Isto significa que nós podemos usar técnicas rápidas da biologia molecular para criar e seleccionar grandes bibliotecas.”