Alta purificación del ácido nucléico de la producción simplificada

insights from industryBats Mutamba & Nans BodetField Support Automation ScientistsPromega Corporation

Una entrevista con los palos Mutamba y Nans Bodet, conducto por James Ives

Dé por favor una reseña del patrón oro actual en la alta purificación del ácido nucléico de la producción. ¿Qué favorece y las limitaciones son éstas para estos métodos?

Palos: El patrón oro histórico para el aislamiento del ácido nucléico ha sido tecnología basada lejos de un flujo de trabajo de la olumna. En el flujo de trabajo regular hay un paso de la lisis, donde las células se toman y se abren para exponer el ácido nucléico al ambiente externo, después a un paso obligatorio sobre una membrana en la olumna, seguida por varios pasos de la estela turbulenta para librarse de cualquier escombro de célula, de las proteínas y de otros materiales fuera de los ácidos nucléicos. En el paso final de la elución, un almacenador intermedio sería empleado para disociar el ácido nucléico de la matriz de la olumna.

Estos flujos de trabajo han cambio desde entonces a las tecnologías moldura-basadas magnéticas, que esencialmente poseen los mismos pasos: la lisis, el atascamiento, el lavado y la elución, pero ésta suceso en una moldura en vez conectado de una olumna.

las tecnologías Olumna-basadas tienen algunas desventajas: los pozos son obstrucción propensa con o sin el uso de los múltiples de vacío. Esto puede ocurrir durante la adición de los almacenadores intermedios así como de los pasos numerosos, incómodos y que toma tiempo de la centrifugación a hacer girar abajo de las olumnas. Éste no es el caso con las tecnologías moldura-basadas, que son tanto sistemas de limpieza considerados con tiempos de procesamiento más cortos.

Nans: Los laboratorios están exigiendo pureza y la adaptabilidad para la alta purificación del ácido nucléico de la producción, mientras que necesitan terminar análisis rio abajo difícil, por ejemplo con la secuencia siguiente de la GEN (“NGS ").

La química basada magnética es el patrón oro porque puede ofrecer mucha pureza, como usted puede seleccionar el tipo apropiado de resina magnética para ajustar su uso y para ajustar para los usos rio abajo más apropiados. Las molduras magnéticas son flexibles en términos de capacidad de conversión a escala y volumen de la entrada de la muestra, así como números de muestras que necesiten ser funcionadas con.

Esto está con respecto a otras técnicas bien conocidas tales como separación basada vacío, donde la placa completa necesita ser utilizada, disminuyendo la adaptabilidad de la técnica, y afectando al volumen de muestra. Una ventaja del método del vacío es la velocidad, puede ofrecer respuestas rápidas, pero no maneja usos rio abajo exigentes así como química moldura-basada magnética.

® ¿Cómo el sistema del HT del maxwell trabaja para purificar la DNA o el ARN? ® ¿Con qué instrumentación el sistema del HT del maxwell trabaja y en qué escalas?

Palos: La química® del HT del maxwell mencionada anterior es predominante una tecnología moldura-basada para aislar los ácidos nucléicos, DNA, ARN o el ácido nucléico total (TNA), que incluye la DNA y el ARN. Si las células necesitan lysed en el paso inicial de la lisis, los almacenadores intermedios específicos serán requeridos, por ejemplo al aislar la DNA de los glóbulos blancos.

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Entonces el ácido nucléico está limitado sobre las molduras magnéticas (o la resina, como la llamamos), que pueden tener diversos tipos de superficies. Adaptamos la química obligatoria para ofrecer la captura óptima de las moléculas del interés. Una vez que el ácido nucléico ata a las molduras magnéticas hay tres o cuatro estelas turbulentas, que pueden ser a base de alcohol, pero para algunos clientes que tengan análisis rio abajo sensibles, tenemos almacenadores intermedios alternativos disponibles.

El paso final es el paso de la elución, implicando el destacamento del ácido nucléico de la moldura con un almacenador intermedio de la elución, la nucleasa riega típicamente libremente o un almacenador intermedio del tris-EDTA (almacenador intermedio de TE). Si los análisis rio abajo de nuestro cliente son sensibles al EDTA, que conocemos somos un agente quelante, después podemos utilizar almacenador intermedio de 25 milímetros Tris.

Los sistemas hemos instalado típicamente proceso de centenares a los millares de muestras. Somos plataforma agnóstica, así que significa que integramos químicas del reactivo sobre cualquier plataforma automatizada que el cliente desee. Esto nos da más adaptabilidad sin forzar a nuestros clientes a decidir sobre los sistemas que pueden no ser ideales para ellos. Ofrecemos recomendaciones y ningunos requisitos duros.

Tenemos cierta instrumentación de Promega que utilicemos para las versiones parciales de programa o la prueba de los estudios del concepto, y hemos trabajado con las compañías de la instrumentación de todos los jugadores grandes incluyendo Hamilton, Tecan, Beckman, ThermoFisher, Eppendorf y muchos otros. Hay una amplia gama de las plataformas que se pueden utilizar para las químicas y nuestras personas tienen conocimiento diverso el scripting o el programar de estas plataformas.

Nans: La belleza del sistema® del HT del maxwell es la química bien-probada, que se puede demostrar fácilmente en el pequeño instrumento® del RSC del maxwell. Tenemos un montón de experiencia con nuestro sistema y podemos escalar la misma química a cualquier clase de producción.

Promega ofrece una solución modificada para requisitos particulares a la purificación del ácido nucléico, describe por favor lo que usted ofrece a sus clientes.

Nans: El cliente o el laboratorio puede tener una muestra muy estándar y tenemos las soluciones establecidas para ella. Sin embargo, la mayor parte del tiempo, las muestras que son probadas serán necesarias para un uso específico, por ejemplo las bacterias de las heces, o los análisis rio abajo pudieron ser muy determinados para este uso, o el volumen requerido es muy diferente.

Pues tenemos una compresión completa de la química requerida, podemos ayudar al laboratorio con una solución modificada para requisitos particulares, pidiendo que el laboratorio nos envía algunas de las muestras para la evaluación. Entonces trabajamos en nuestros laboratorios del uso hacia adentro en el mundo entero para probar diversas soluciones de la química en las muestras y para definir todos los volúmenes requeridos para el mejor funcionamiento del uso rio abajo.

De acuerdo con eso, podemos ajustar nuestra oferta final, nosotros podemos proveer de un estuche estándar para este uso los reactivos extras si procede o hacer un estuche completo modificado para requisitos particulares, con el mismo número de lote por el año entero para el laboratorio.

Palos: Como Nans mencionó no hay ningún un cliente que vaya a querer el exacto el mismo flujo de trabajo con el exacto la misma producción, así que Promega tiene dos grupos adicionales que sean responsables del arreglo para requisitos particulares. Nuestras personas del FSS (“científicos del apoyo del campo ") trabajan así como las aduanas y el grupo de la solución del OEM así como un departamento de orden de aduanas (COD), que manejan la tasación a granel, ordenar y configuraciones de encargo del estuche.

Por ejemplo, si usted es un cliente que quiere perseguir una química específica, y usted no quiera entrar sus tiempos múltiples de las botellas de reactivo por corrida, nosotros puede empaquetar los reactivos de una manera modificada para requisitos particulares para su laboratorio. Trabajamos con nuestros clientes y nuestras personas de atención al cliente para trabajar en diversas configuraciones del estuche que sean óptimas para su flujo de trabajo. Si no es una configuración estándar del estuche, tenemos la capacidad personalización-de hacer los reactivos o el empaquetado para ayudar a nuestros clientes, ninguna materia el nivel de la producción.

® ¿Cómo las personas de apoyo de encargo de la purificación del ácido nucléico del HT del maxwell salvan tiempo y reducen la tensión?

Palos: Las personas del FSS primero trabajan con el cliente y el representante local para desarrollar una comprensión de los requisitos para los flujos de trabajo del laboratorio y las necesidades de la automatización. Las personas utilizan nuestra experiencia en sistemas y las químicas automatizados de Promega para ofrecer las recomendaciones para que el cliente considere y después ayudarán al cliente en el laboratorio para programar el instrumento, para entrenar al laboratorio en usar el instrumento y la química y para ofrecer el apoyo en curso.

Nans: Tenemos un proceso muy bien-establecido, primero en términos de documentación del flujo de trabajo, nosotros cerco requisitos entonces que tenemos una declaración del trabajo donde definimos las expectativas del laboratorio como las vemos y entendemos. Compartimos esto con el laboratorio antes de que vayamos para que la puesta en vigor in situ compruebe con minuciosidad que ambas expectativas igualan. Con esto salvamos mucho tiempo.

También salvamos gracias del tiempo a nuestro conocimiento muy grande de la automatización dentro de las personas, todos los colegas de las personas han estado trabajando durante mucho tiempo en el campo de la automatización, así que podemos soportar el laboratorio en la definición de la mejor solución de la automatización si proyectan en comprar un instrumento o si tienen ya robots en su laboratorio, dando el mejor consejo en el cual los parámetros deben ser utilizados y el cual los módulos.

Los gracias a nuestra experiencia podemos también ayudar verdad al laboratorio para ejecutar la química porque apenas no estamos vendiendo una caja de química y sentarse detrás del cliente para hacer que hagan su cosa. Tomamos el mando de la computador y definimos todos los protocolos manualmente sin ayuda adicional.

Estamos aquí entregar funcionamiento biológico, éste es generalmente algo que los clientes y el laboratorio no preveen debido a experiencias malas del pasado con otras compañías. Sin embargo, en nuestro caso estamos realmente aquí entregar funcionamiento biológico, y éste ayuda a la disminución el nivel de tensión del laboratorio.

¿Qué clase de problemas de la purificación del HT las personas han ayudado a clientes a resolver?

Palos: Recibimos a menudo preguntas de los laboratorios que son cualquier automatización de laboratorio existente de la re-tarea que intenta a un nuevo proceso o están eligiendo comenzar a invertir en la automatización de laboratorio.  Esos clientes pueden no tener experiencia de la automatización y aprecian la capacidad de consultar con los expertos de automatización mientras que están considerando diversas opciones.

Hasta problemas específicos de la extracción, somos más que felices de ayudar a resolverlos. En nuestras personas, podemos ir siempre en sitio y trabajar con un cliente en sus tipos difíciles de la muestra o la otra opción es el cliente tiene la opción para enviarnos muestras donde nuestras personas científicas de los usos trabajarán en una solución para esos tipos determinados de la muestra.

Entonces enviaremos esas muestras de nuevo al cliente, y pueden entonces probar los aislantes usando sus análisis rio abajo. Nos enorgullecemos como especialistas de la automatización en tener la capacidad de ayudar a un cliente en sitio con scripting o la programación.

Nans: ¡En un caso con una compañía de biotecnología en Francia, quisieron hacer la purificación del plásmido, normalmente fácil, pero puesto que su proceso rio abajo era trabajar en la transfección y la proliferación del anticuerpo, necesitaron mucho rendimiento realmente enorme de los plásmidos-uno!

Necesitaron automatizar midipreps a partir de 20-30 ml de culturas, algo que no habíamos hecho antes. Sin embargo, puesto que hemos tenido lotes de éxito en formato del miniprep en 96 pozos, intentamos eso en nuestro laboratorio primero con las culturas y las muestras de Promega. Con las muestras internamente desarrolladas intentamos activar manualmente los límites de nuestra química para ver si podría manejar la variación del midiprep.

Una vez que teníamos eso el trabajar, preguntamos a cliente si podrían proveer de nosotros algo de su cultura a las diferencias de la prueba entre las muestras internas y el externo unos. Probamos si trabajó manualmente con estas muestras y entonces, puesto que teníamos cierta confianza en nuestra química y tenemos automatización en nuestros laboratorios, nosotros puso la química en el instrumento automatizado en 24 formatos del pozo profundo para manejar la escala del volumen similar al midiprep.

Después de algunas semanas del revelado, podíamos desarrollar un protocolo ajustado para manejar los midipreps y después fuimos al sitio del laboratorio en Marsella a ejecutarla y a ajustar más lejos para las necesidades del laboratorio. Esto ha sido una instalación muy acertada porque el laboratorio es muy feliz y podíamos escribir un asentador combinado juntos.

¿Cómo pueden las personas ayudar a laboratorios con plataforma de la instrumentación?

Nans: Una vez que usted automatiza una química en una plataforma que es bastante directa mover eso encima a otras plataformas porque las cuestiones claves están definiendo básicamente el líquido apropiado que maneja parámetros, por ejemplo: ¿Es esta muestra viscosa o no? ¿Qué debe la temperatura de la incubación y velocidad de la sacudida ser?

Una vez que usted tiene eso y usted tiene un conocimiento básico de la automatización que es fácil traducir a cualquier otro lenguaje de la automatización. Dentro de las nuestras personas todos tenemos experiencia anterior de la industria. Trabajé por 10 años en Tecan antes de ensamblar Promega y usted encontrará experiencia similar en todos mis colegas en las personas del FSS. Desde que crearon a las personas hace 8 años, hemos producido tan muchos patrones que para requisitos particulares podemos utilizar y después modificar a cualquier plataforma.

Palos: Nuestras personas son tan diversas en términos de conocimiento combinado que hemos recolectado a lo largo de los años en diversas plataformas. El software que mide con una pipeta puede ser muy diferente en términos de programación pero, generalmente, si usted tiene una buena maneta en la química y si usted puede programar en una del líquido más grande que maneja las plataformas, después el líquido que maneja en conjunto no es tan incómodo como usted puede ser que piense.

Como grupo que tiene ese fondo y conocimiento diversos en la automatización sin procesar, no vamos a dictar qué plataforma elige un cliente para nuestra química. Tenemos recomendaciones para las cuales automatizó el trabajo de las plataformas mejor que otros, algunos tenemos más flexibilidad o adaptabilidad, pero el mensaje para llevar aquí es que somos plataforma agnóstica. No cuidamos que la plataforma el cliente utiliza con nuestra química.

¿Qué muestra desafiadora pulsan las personas encontradas y han podido soportar?

Nans: Había últimamente un foco en el microbiome. Hay mucho interés en amplificar los ácidos nucléicos de las heces, no sólo heces humanas pero también los ratones y la otra especie, que es típicamente difícil de manejar debido a la suciedad de la muestra, y es generalmente muy difíciles ganar un eluído limpio.

También tenemos lotes de los pedidos muestras de la instalación. Los gracias a uno de nuestras químicas específicas, del maxwell® RSC PureFood GMO y del estuche de la autentificación, es fácil purificar estas muestras difíciles. Tenemos que manejar siempre cuidadosamente el almacenamiento, la entrada y el manejo de la muestra, pero por otra parte somos muy acertados en este campo.

Palos: También hemos tenido los clientes que tienen quisieron extraer la DNA de los crustáceos y de los diversos crustáceos, en el soldado de infantería de marina y el sector de Biotech. ¡También hemos tenido peticiones de extraer el ácido nucléico de las uñas y de los clavos! La gente olvida a menudo que hay mucha DNA y ARN en los clavos, así como los folículos de pelo. Hemos tratado de todos esos tipos de muestras.

El fondo es incluso si no tenemos experiencia con un tipo específico de la muestra, los clientes tiene la opción de enviarnos esas muestras a través en Madison en donde trabajamos de común acuerdo con los científicos para conseguir su extracto para trabajar.

® ¿Qué garantías se ofrecen a los clientes sobre la calidad de los sistemas del HT del maxwell?

Nans: Promega como compañía tiene un gran historial en este campo, así que diría que éste es el primer nivel de garantía. Entonces, por supuesto, tenemos gusto siempre de duplicar y la verificación triple todo y nosotros tenemos gusto de intentar la muestra del laboratorio con nuestro sistema® del RSC del maxwell, que es muy fácil de manejar y de demostrar en sitio.

En el nuestro o laboratorio del cliente, podemos probar la muestra sobre una hora permitiendo que nuestro cliente vea para ellos mismos si la química está trabajando como se esperaba.

Cuando un laboratorio expide una muestra a Madison o a Lyon, en donde podemos ajustar los parámetros de la automatización del experimento, escribimos un parte y enviamos el eluído de nuevo al laboratorio del cliente así que pueden también tener una mirada sin obstrucción en la DNA y el ARN y considerar para ellos mismos que está trabajando. Si el laboratorio es feliz, entonces vendríamos en sitio y relanzaríamos este trabajo con sus científicos y su plataforma, que ofrece una alta cantidad de garantía.

Palos: Podemos demostrar que nuestros eluídos están al patrón que el laboratorio prevee probando la muestra resultante. Nuestra garantía del éxito para nuestros clientes es que no miente la química.

Por ejemplo, con una química de la purificación del ácido nucléico, hay índices de la pureza para el control de calidad de las muestras. Hay dos índices que observamos cuando aislamos la DNA y/o el ARN, primer somos la índice A260-280 que mide básicamente cualquier contaminación de la proteína en su muestra del ácido nucléico. Cuando usted prueba sus muestras, usted puede preveer que la índice sea cerca de 1,8 a 1,9. Si hay las proteínas o la otra contaminación en la muestra, la índice será es decir un 0,7 a 1,3 importante más inferiores. Esto le informa qué clase de tiene una muestra usted y cómo es acertado fue el aislamiento.

La segunda índice es la índice A230-260, que esencialmente las dimensiones lavan los almacenadores intermedios o el desecho llevados en el flujo de trabajo. Del paso de la lisis, paso obligatorio, paso del lavado al paso de la elución, si ningunos de esos componentes indeseables se llevan con el flujo de trabajo que la índice le mostrará. Buscamos típicamente índices de 1.7-2.1, y si cae a 0.7-1.0 usted sabe que hay niveles del almacenador intermedio o de los materiales de desecho llevados con el flujo de trabajo.

Además de eso entonces trabajaremos con el cliente en los procesos rio abajo. Típicamente, si el sistema trabaja y las extracciones eran acertado que se deben demostrar en ésos los análisis rio abajo.

® ¿Qué el futuro espera para Promega y las personas del HT del maxwell?

Nans: De una perspectiva de las personas hemos sido muy acertados, hace 5 años las personas eran apenas 2 personas en los E.E.U.U. y ahora somos 9 personas y actualmente el observar para contratar a una nueva persona en Europa. Nos estamos desplegando y también estamos intentando educar a gente sobre la automatización en nuestra organización para hacerla enterada de los retos típicos de la automatización en el laboratorio, así que podemos ser aún más acertados en este campo.

Palos: En términos de futuro, nos excitan sobre nuevas tecnologías que los científicos están trabajando conectado en academia, hospital y los laboratorios clínicos, y pharma y Biotech. Por ejemplo, aislamientos del plásmido para CRISPR, la producción sintetizada de la DNA y las actividades bancarias de la sangre, donde las enormes cantidades de sangre se aíslan para ofrecer productos del ácido nucléico a los clientes. Hemos visto lotes de la demanda en estas áreas.

Como Nans mencionó, nuestras personas son excepcionales. Pienso como la tecnología se está ejecutando delante, nosotros soy dinámico y veo donde nuestras químicas y nuestra automatización pueden ser utilizadas mejor.

¿Dónde pueden los programas de lectura encontrar más información?

https://www.promega.com/products/dna-purification-quantitation/high-throughput-nucleic-acid-purification/maxwell-ht-nucleic-acid-purification/

Sobre Nans Bodet

Nans Bodet, es científico de la automatización del apoyo del campo en Promega Corporation basada en Francia y el revestimiento del EMEA por los cinco años pasados. Él detectó un capitán de la biología, de la fisiología y de la inmunología celulares en la universidad de Marsella Luminy.

Antes de ensamblar Promega, él trabajó en Tecan Francia como especialista del uso y después ensambló las comandancias de Tecan en Maennedorf (CH) para ser administrador de cuentas global del apoyo y de la llave de la frente. En Promega, Nans se está centrando en combinar las soluciones de Promega con toda la clase de automatización para facilitar retos de los laboratorios.

Sobre los palos Mutamba

Los palos Mutamba, científico de la automatización del apoyo del campo con Promega Corporation por tres años, eran nacidos y aumentados en Zimbabwe con un fondo en microbiología, bioquímica y biotecnología de la universidad de Rodas, Suráfrica.

Él se trasladó a los E.E.U.U. en donde él terminó capitanes en la nutrición celular y molecular de UNC Greensboro. En Duke University, él trabajó como analista de la investigación antes de ser empleado por Tecan como especialista del producto para los sistemas Célula-Basar.

Un rato más adelante, los palos continuaron trabajar para una compañía de la nanotecnología como científico de la investigación en el desarrollo de productos, utilizando los nanoparticles de plata para los diversos usos antimicrobianos. Él trabajó más adelante para el desarrollo de productos farmacéutico en (PPD) Richmond, VA de la CRO (COORDINADORA) como científico mayor responsable del revelado y de la validación de diversos análisis usando el manejo líquido automatizado.

Él después volvió a poner con su familia a Phoenix, Arizona en donde él trabajó para las ciencias de la vida de Caris, compañía molecular de los diagnósticos que se especializaba en cáncer y personalizó el remedio. En su papel como científico de la investigación él purposed con convertirse y el laboratorio automático desarrolló las pruebas (LDTs) para la detección temprana y la diagnosis del cáncer del pecho y de próstata.

Citations

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