Les chercheurs développent la technique simple et rapide pour la retouche de gène dans le champignon de souffle de riz

CRISPR/Cas9 est maintenant un nom de famille lié aux études de génie génétique. Par la recherche tranchante décrite en leur papier publié dans des états scientifiques, une équipe de recherche d'université de Tokyo de la Science, d'université de Meiji, et d'université de Tokyo d'agriculture et de technologie, aboutie par M. Takayuki Arazoe et prof. Shigeru Kuwata, a récent déterminé une suite de stratégies nouvelles pour augmenter le rendement de la disruption de génique visée et du gène neuf « introduction » utilisant le système CRISPR/Cas9 dans l'oryzae cryptogamique de Pyricularia de souffle de riz (Magnaporthe). Ces stratégies comprennent une introduction (en pas à pas) plus rapide de gène, une utilisation de petites séquences homologues, et la dérivation de certain hôte préalable ADN « configurations » et modification de composante d'hôte.

L'équipe aboutie par M. Arazoe et prof. Kuwata a conçu des techniques simples et rapides pour la retouche de gène (disruption de gène cible, remplacement de séquence, et réintroduction de gènes désirés) utilisant CRISPR/Cas9 dans l'oryzae cryptogamique de Pyricularia de souffle de riz (Magnaporthe), un type de champignon filamenteux. Incité par des résultats d'une manière encourageante, les chercheurs conjecturent, des « centrales et leurs agents pathogènes coevolving toujours en nature. L'exploitation des mécanismes de mutation des champignons pathogènes modèles comme technique de retouche de génome pourrait mener au développement encore d'autres de techniques nouvelles en génie génétique. »

La composante fonctionnante du système CRISPR/Cas9 grippe à la région de gène cible (ADN) et aux causes une interruption bicaténaire de site-détail (DSB) dans l'ADN. Le grippement efficace de cette composante exige un certain « motif » ou la « configuration » appelée le motif protospacer-adjacent (PAM), qui suit en aval de la région de gène cible.

La plupart des techniques de retouche de génome exigent DSBs induit au site d'objectif, qui déclenchent des voies de « réglage » d'ADN dans l'hôte. La recombinaison homologue (HR) est un mécanisme pour le réglage de DSBs, et il est utile parce qu'elle ajoute des séquences complémentaires. Cependant, la méthodologie fondamentale est laborieuse, et son rendement dépend conventionnel des facteurs externes tels que les propriétés ainsi que le PAMs d'hôte. L'heure peut être divisée en deux voies : type de « noncrossover » (conversion de gène) et de « croisement ». des réglages de Croisement-type sont connus pour se produire en cellules qui subissent la méiose. Cependant, la compréhension de leur rôle en cellules qui subissent la mitose est limitée, et une telle information sur les champignons filamenteux est pratiquement indisponible. C'est cet écartement dans la connaissance que les chercheurs examinaient pour adresser.

Dans leur étude, les chercheurs ont produit la première fois un vecteur (système de distribution de gène) basé sur CRISPR/Cas9 pour confirmer le croisement-type heure dans la région réceptive de gène dans le champignon de souffle de riz.

Puis, pour vérifier la désignation d'objectifs de gène ou le « remplacement de séquence, » ils ont produit un vecteur de « mutant », optimisé pour le croisement-type unique heure, pour la perturbation visée du gène d'hôte qui code la dehydratase de scytalone (SDH), une protéine impliquée dans la formation de mélanine. Ce vecteur a été introduit dans le vecteur contenant le gène pour le phosphotransferase du hygromycin B (hph), qui s'entretient résistance au hygromycin antibiotique B. Les chercheurs ont spéculé que le croisement-type unique heure insérerait le vecteur entier avec le hph dans le site d'objectif. Les mutants avec le gène abrupt de CSAD seraient recensés en tant que colonies blanches (dû à la perte de mélanine) sur un hygromycin contenant moyen B. Les chercheurs ont constaté que le nombre de colonies blanches B-résistantes de hygromycin a considérablement augmenté à l'aide du vecteur CRISPR/Cas9, ainsi il signifie que le système CRISPR/Cas9 est efficace en induisant la seule HEURE de croisement-type. L'avantage le plus grand de cette technique est qu'il a besoin de séquences homologues extrêmement courtes (100 paires de bases ; ce qui est réellement petit en biologie moléculaire).

Les chercheurs avaient l'habitude également une stratégie assimilée pour vérifier si l'introduction de gène (ou le « coup dans ») est possible par l'intermédiaire du croisement-type unique heure utilisant un vecteur CRISPR/Cas9. Ils ont employé le gène de la protéine vert-fluorescent (GFP), qui est très utilisé comme un gène de « journaliste » pour effectuer à des cellules hôte la lueur vert fluorescent une fois inséré dans leur génome. Ils ont spéculé que le croisement unique heure aurait comme conséquence l'introduction du GFP dans la séquence réceptive. En effet, ils ont constaté que l'utilisation du vecteur CRISPR/Cas9 a provoqué les colonies fluorescentes vertes sur le support de hygromycin. Ces découvertes prouvent que le système CRISPR/Cas9 peut être employé pour le gène « en une étape » efficace coup-dans.

Cette recherche se dirige vers un fait étonnant que, peut-être, PAMs ne sont pas tout qui nécessaire pour la retouche du gène CRISPR/Cas9 dans les champignons. Grêlant la réussite de la recherche, les conditions d'équipe, « nous avons constaté que les champignons filamenteux ont de seules caractéristiques génomiques, où les croisements sont fréquemment induits, même en cellules somatiques, en fendant l'objectif ADN. Nous avions l'habitude ces caractéristiques pour perturber l'objectif ADN et pour introduire des gènes de « journaliste ». Nous avons également réussi à augmenter le rendement et la vitesse du coup-dans, utilisant un procédé en pas à pas. Cette technologie surmonte la restriction posée par PAMs--ce qui est l'un des plus grands désavantages du système CRISPR/Cas9--et active une retouche plus flexible de génome, qui a été difficile dans des études précédentes sur les champignons filamenteux. »

En conclusion, une fois enquis des applications plus grandes de ces recherche, condition de M. Arazoe et de prof. Kuwata par éloquence :

Le champignon de souffle de riz est un agent pathogène important qui entraîne la maladie destructrice du riz, qui est l'aliment principal du pays. La technique de retouche de génome de CRISPR/Cas9-based développée dans notre étude peut accélérer la recherche biologique moléculaire sur cet agent pathogène, éventuel contribuant à l'apport alimentaire stable et à la sécurité alimentaire centrale centrale. En outre, cette technique s'applique à d'autres champignons filamenteux très utilisés dans l'industrie--particulièrement dans le bioprocessing, la nourriture, et les industries de fermentation. »

Source :

Université de Tokyo de la Science

Référence de tourillon :

Yamato, 2019) remplacements visés croisement-assistés uniques de nucléotide de T. et autres (et coup-dans des stratégies avec le système CRISPR/Cas9 dans le champignon de souffle de riz. États scientifiques. doi.org/10.1038/s41598-019-43913-0.