I ricercatori sviluppano la tecnica semplice e rapida per il gene modificare nel fungo di fischio del riso

CRISPR/Cas9 ora è un nome conosciuto connesso con gli studi dell'ingegneria genetica. Con la ricerca di avanguardia descritta in loro documento pubblicato nei rapporti scientifici, un gruppo dei ricercatori dall'università di Tokyo di scienza, l'università Meiji e l'università di Tokyo di agricoltura e di tecnologia, piombo dal Dott. Takayuki Arazoe e da prof. Shigeru Kuwata, recentemente ha stabilito una serie di strategie novelle per aumentare il risparmio di temi di rottura mirata a del gene e di nuovo gene “introduzione„ facendo uso del sistema CRISPR/Cas9 nell'oryzae di Pyricularia del fungo di fischio del riso (Magnaporthe). Queste strategie comprendono l'introduzione (a passo singolo) più rapida del gene, l'uso di piccole sequenze omologhe ed oltrepassare di determinato DNA indispensabile “reticoli„ e modifica ospite della componente ospite.

Il gruppo piombo dal Dott. Arazoe e da prof. Kuwata ha inventato le tecniche semplici e rapide per il gene che modifica (rottura del gene dell'obiettivo, sostituzione di sequenza e rintroduzione di geni desiderati) facendo uso di CRISPR/Cas9 nell'oryzae di Pyricularia del fungo di fischio del riso (Magnaporthe), un tipo di fungo filamentoso. Incitato tramite i risultati incoraggianti, i ricercatori congetturano, “impianti ed i loro agenti patogeni ancora coevolving in natura. Lo sfruttamento dei meccanismi di mutazione dei funghi patogeni di modello come genoma che modificano la tecnica ha potuto piombo allo sviluppo di ulteriori tecniche novelle nell'ingegneria genetica.„

La componente di lavoro del sistema CRISPR/Cas9 lega alla regione del gene dell'obiettivo (DNA) e le cause un a doppia elica sito-specifico irrompono (DSB) il DNA. L'efficace associazione di questa componente richiede un determinato “motivo„ o “il reticolo„ chiamato il motivo protospacer-adiacente (PAM), che segue a valle della regione del gene dell'obiettivo.

La maggior parte del genoma che modifica le tecniche richiede DSBs indotto al sito dell'obiettivo, che avviano le vie “della riparazione„ del DNA nel host. La ricombinazione omologa (HR) è un meccanismo per la riparazione di DSBs ed è utile perché aggiunge le sequenze complementari. Tuttavia, la metodologia di fondo è laboriosa ed il suo risparmio di temi dipende convenzionalmente dai fattori esterni quali i beni come pure il PAMs ospite. L'ora può essere divisa in due vie: tipo dell'incrocio “e) conversione del gene („„ “del noncrossover. le riparazioni Incrocio tipe sono conosciute per accadere in celle che subiscono la meiosi. Tuttavia, la comprensione del loro ruolo in celle che subiscono la mitosi è limitata e tali informazioni sui funghi filamentosi è virtualmente non disponibile. È questo spazio nella conoscenza che i ricercatori stavano guardando per indirizzare.

Nel loro studio, i ricercatori in primo luogo hanno creato un vettore (delivery system del gene) basato su CRISPR/Cas9 per confermare l'ora incrocio tipa nella regione ricevente del gene nel fungo di fischio del riso.

Poi, controllare la sostituzione di sequenza “o di individuazione dei geni,„ hanno creato un vettore “mutante„, ottimizzato per la singola ora incrocio tipa, per rottura mirata a del gene ospite che codifica la deidratasi di scytalone (SDH), una proteina coinvolgere nella formazione della melanina. Questo vettore è stato introdotto nel vettore che contiene il gene per il phosphotransferase di hygromycin B (hph), che conferisce la resistenza al hygromycin antibiotico B. I ricercatori hanno speculato che la singola ora incrocio tipa avrebbe inserito l'intero vettore con hph nel sito dell'obiettivo. I mutanti con il gene interrotto dell'SADH sarebbero identificati come colonie bianche (a causa di perdita di melanina) su un hygromycin contenente medio B. I ricercatori hanno trovato che il numero delle colonie bianche B-resistenti di hygromycin è aumentato drammaticamente usando il vettore CRISPR/Cas9, in modo da significa che il sistema CRISPR/Cas9 è efficace nell'induzione dell'ORA incrocio tipa singola. Il più notevole vantaggio di questa tecnica è che ha bisogno di sequenze omologhe estremamente brevi (100 coppie di basi; quale è realmente piccolo nella biologia molecolare).

I ricercatori egualmente hanno usato una simile strategia per controllare se l'introduzione del gene (o “colpo in„) è possibile via la singola ora incrocio tipa facendo uso di un vettore CRISPR/Cas9. Hanno usato il gene verde-fluorescente (GFP) della proteina, che è ampiamente usato come un gene “del reporter„ rendere a cellule ospiti l'incandescenza verde fluorescente una volta inserito nel loro genoma. Hanno speculato che il singolo incrocio ora avrebbe provocato l'introduzione di GFP nella sequenza ricevente. Effettivamente, hanno trovato che l'uso del vettore CRISPR/Cas9 ha provocato le colonie fluorescenti verdi sul media di hygromycin. Questi risultati indicano che il sistema CRISPR/Cas9 può essere usato per il gene “una tappa„ efficiente colpo-in.

Questa ricerca indica verso un fatto sorprendente che, forse, PAMs non è tutto che necessario per il gene CRISPR/Cas9 che modifica nei funghi. Salutando il successo della ricerca, gli stati del gruppo, “abbiamo trovato che i funghi filamentosi hanno caratteristiche genomiche uniche, in cui gli incroci sono indotti frequentemente, anche in somatociti, fendendo il DNA dell'obiettivo. Abbiamo usato queste caratteristiche per interrompere il DNA dell'obiettivo e per presentare i geni “del reporter„. Egualmente siamo riuscito a aumentare il risparmio di temi e la velocità del colpo-in, facendo uso di un trattamento a passo singolo. Questa tecnologia sormonta la restrizione posata da PAMs--quale è uno di più grandi svantaggi del sistema CRISPR/Cas9--e permette al genoma più flessibile che modifica, che è stato difficile negli studi precedenti sui funghi filamentosi.„

Per concludere, una volta chiesto notizie sulle più vaste applicazioni di questi ricerca, stato di Dott. Arazoe e di prof. Kuwata eloquente:

Il fungo di fischio del riso è un agente patogeno importante che causa la malattia distruttiva di riso, che è l'alimento principale del paese. Il genoma di CRISPR/Cas9-based che modifica la tecnica sviluppata nel nostro studio può accelerare la ricerca biologica molecolare su questo agente patogeno, infine contribuendo all'approvvigionamento di generi alimentari stabile ed alla sicurezza alimentare impianta impianto. Inoltre, questa tecnica è applicabile ad altri funghi filamentosi ampiamente usati nell'industria--particolarmente nel bioprocessing, nell'alimento e nelle industrie di fermentazione.„

Sorgente:

Università di Tokyo di scienza

Riferimento del giornale:

Yamato, 2019) singole sostituzioni mirate a incrocio-mediate del nucleotide del T. et al. (e colpo-nelle strategie con il sistema CRISPR/Cas9 nel fungo di fischio del riso. Rapporti scientifici. doi.org/10.1038/s41598-019-43913-0.