Os pesquisadores desenvolvem a técnica simples, rápida para o gene editando no fungo da explosão do arroz

CRISPR/Cas9 é agora um nome muito conhecido associado com os estudos da genética. Com a pesquisa pioneiro descrita em seu papel publicado em relatórios científicos, uma equipe dos pesquisadores da universidade de Tóquio de ciência, da universidade de Meiji, e da universidade do Tóquio da agricultura e da tecnologia, conduzida pelo Dr. Takayuki Arazoe e pelo prof. Shigeru Kuwata, tem estabelecido recentemente uma série de estratégias novas para aumentar a eficiência do rompimento visado do gene e do gene novo “introdução” que usa o sistema CRISPR/Cas9 no oryzae de Pyricularia do fungo da explosão do arroz (Magnaporthe). Estas estratégias incluem uma introdução (de uma etapa) mais rápida do gene, um uso de seqüências homólogos pequenas, e contornear de determinado ADN necessário “testes padrões” e alteração do anfitrião do componente do anfitrião.

A equipe conduzida pelo Dr. Arazoe e pelo prof. Kuwata planejou técnicas simples e rápidas para o gene que edita (rompimento do gene do alvo, substituição da seqüência, e reintrodução de genes desejados) usando CRISPR/Cas9 no oryzae de Pyricularia do fungo da explosão do arroz (Magnaporthe), um tipo de fungo filamentous. Spurred sobre por resultados encorajadores, a conjectura dos pesquisadores, as “plantas e seus micróbios patogénicos ainda coevolving na natureza. Explorar os mecanismos da mutação dos fungos patogénicos modelo como um genoma que editam a técnica pôde conduzir à revelação de umas técnicas novas mais adicionais na genética.”

O componente de trabalho do sistema CRISPR/Cas9 liga à região do gene do alvo (ADN) e às causas uma ruptura dobro-encalhada local-específica (DSB) no ADN. O emperramento eficaz deste componente exige um determinado “motivo” ou o “teste padrão” chamado o motivo protospacer-adjacente (PAM), que segue rio abaixo da região do gene do alvo.

A maioria de genoma que edita as técnicas exige DSBs induzido no local do alvo, que provocam caminhos do “reparo” do ADN no anfitrião. A recombinação homólogo (HR) é um mecanismo para o reparo de DSBs, e é útil porque adiciona seqüências complementares. Contudo, a metodologia subjacente é laboriosa, e sua eficiência depende convencionalmente dos factores externos tais como as propriedades assim como o PAMs do anfitrião. A hora pode ser dividida em dois caminhos: tipo do “noncrossover” (conversão do gene) e do “cruzamento”. o Cruzamento-tipo reparos é sabido para ocorrer nas pilhas que se submetem à meiose. Contudo, a compreensão de seu papel nas pilhas que se submetem à cariocinese é limitada, e tal informação em fungos filamentous é virtualmente não disponível. É esta diferença no conhecimento que os pesquisadores estavam olhando para endereçar.

Em seu estudo, os pesquisadores criaram primeiramente um vector (sistema de entrega do gene) baseado em CRISPR/Cas9 para confirmar o cruzamento-tipo hora na região destinatária do gene no fungo da explosão do arroz.

Então, para verificar a escolha de objectivos do gene ou da “a substituição seqüência,” criaram um vector do “mutante”, aperfeiçoado para o único cruzamento-tipo hora, para o rompimento visado do gene do anfitrião que codifica o dehydratase do scytalone (SDH), uma proteína envolvida na formação da melanina. Este vector foi introduzido no vector que contem o gene para o phosphotransferase do hygromycin B (hph), que confere resistência ao hygromycin antibiótico B. Os pesquisadores especularam que o único cruzamento-tipo hora introduziria o vector inteiro junto com o hph no local do alvo. Os mutantes com o gene interrompido do ASAO seriam identificados como as colônias brancas (devido à perda de melanina) em um hygromycin de contenção médio B. Os pesquisadores encontraram que o número de colônias brancas B-resistentes do hygromycin aumentou dramàtica usando o vector CRISPR/Cas9, assim que significa que o sistema CRISPR/Cas9 é eficaz em induzir o único cruzamento-tipo HORA. O grande benefício desta técnica é que precisa seqüências homólogos extremamente curtos (100 pares baixos; qual é realmente pequeno na biologia molecular).

Os pesquisadores igualmente usaram uma estratégia similar para verificar se a introdução do gene (ou a “batida em”) fossem possível através do único cruzamento-tipo hora usando um vector CRISPR/Cas9. Usaram o gene verde-fluorescente (GFP) da proteína, que é amplamente utilizado como um gene do “repórter” fazer a fulgor das pilhas de anfitrião o verde fluorescente quando introduzido em seu genoma. Especularam que o único cruzamento hora conduziria à introdução de GFP na seqüência destinatária. Certamente, encontraram que o uso do vector CRISPR/Cas9 causou colônias fluorescentes verdes no media do hygromycin. Estes resultados mostram que o sistema CRISPR/Cas9 pode ser usado para o gene “de uma etapa” eficiente batida-em.

Esta pesquisa aponta para um facto surpreendente que, talvez, PAMs não seja todo o que necessário para o gene CRISPR/Cas9 que edita nos fungos. Saudando o sucesso da pesquisa, os estados da equipe, “nós encontramos que os fungos filamentous têm características genomic originais, onde os cruzamentos são induzidos freqüentemente, mesmo em pilhas somáticas, fendendo o ADN do alvo. Nós usamos estas características para interromper o ADN do alvo e para introduzir genes do “repórter”. Nós igualmente sucedemos em aumentar a eficiência e a velocidade do batida-em, usando um processo de uma etapa. Esta tecnologia supera a limitação levantada por PAMs--qual é uma das desvantagens as mais grandes do sistema CRISPR/Cas9--e permite um genoma mais flexível que edita, que seja difícil em estudos precedentes em fungos filamentous.”

Finalmente, quando inquirido sobre as aplicações mais largas destes pesquisa, estado do Dr. Arazoe e do prof. Kuwata eloquently:

O fungo da explosão do arroz é um micróbio patogénico importante que cause a doença destrutiva do arroz, que é o alimento de grampo do país. O genoma de CRISPR/Cas9-based que edita a técnica desenvolvida em nosso estudo pode acelerar a pesquisa biológica molecular sobre este micróbio patogénico, contribuindo finalmente à cadeia alimentar estável e à segurança alimentar planta-baseada. Também, esta técnica é aplicável a outros fungos filamentous amplamente utilizados na indústria--especialmente no bioprocessing, no alimento, e nas indústrias da fermentação.”

Source:

Universidade de Tóquio de ciência

Referência do jornal:

Yamato, substituições visadas cruzamento-negociadas do nucleotide do T. e outros (2019) únicas e batida-em estratégias com sistema CRISPR/Cas9 no fungo da explosão do arroz. Relatórios científicos. doi.org/10.1038/s41598-019-43913-0.