Los investigadores desarrollan la técnica simple, rápida para el gen corrigiendo en hongo del chorro del arroz

CRISPR/Cas9 ahora es un nombre muy conocido asociado a estudios de la ingeniería genética. Con la investigación punta descrita en su papel publicado en partes científicos, las personas de investigadores de la universidad de Tokio de la ciencia, de la universidad de Meiji, y de la universidad de Tokio de la agricultura y de la tecnología, llevada por el Dr. Takayuki Arazoe y profesor Shigeru Kuwata, han establecido recientemente una serie de estrategias nuevas para aumentar la eficiencia de la desorganización apuntada y del nuevo gen “introducción” del gen usando el sistema CRISPR/Cas9 en las Oryzae fungosas de Pyricularia del chorro del arroz (Magnaporthe). Estas estrategias incluyen una introducción (de un solo paso) más rápida del gen, el uso de pequeñas series homólogas, y sobrepasar de cierta DNA necesaria de antemano “configuraciones” y modificación del ordenador principal del componente del ordenador principal.

Las personas llevadas por el Dr. Arazoe y profesor Kuwata han ideado las técnicas simples y rápidas para el gen que corregía (desorganización del gen del objetivo, substitución de la serie, y reintroducción de genes deseados) usando CRISPR/Cas9 en las Oryzae fungosas de Pyricularia del chorro del arroz (Magnaporthe), un tipo de hongo filamentoso. Estimulado conectado por resultados encouraging, los investigadores conjeturan, las “instalaciones y sus patógeno todavía coevolving en naturaleza. Explotar los mecanismos de la mutación de los hongos patógenos modelo como genoma que corregían técnica pudo llevar al revelado de otras técnicas nuevas en la ingeniería genética.”

El componente de trabajo del sistema CRISPR/Cas9 ata a la región del gen del objetivo (DNA) y a las causas un interruptor doble-trenzado sitio-específico (DSB) en la DNA. El atascamiento efectivo de este componente requiere cierto “adorno” o la “configuración” llamada el adorno protospacer-adyacente (PAM), que sigue río abajo desde la región del gen del objetivo.

La mayoría del genoma que corrige las técnicas requiere DSBs inducido en el sitio del objetivo, que accionan caminos de la “reparación” de la DNA en el ordenador principal. La recombinación homóloga (HR) es un mecanismo para la reparación de DSBs, y es útil porque agrega series complementarias. Sin embargo, la metodología subyacente es laboriosa, y su eficiencia depende convencional de factores externos tales como las propiedades así como el PAMs del ordenador principal. La hora se puede dividir en dos caminos: tipo del “noncrossover” (conversión del gen) y de la “cruce”. el Cruce-tipo reparaciones se sabe para ocurrir en las células que experimentan meiosis. Sin embargo, la comprensión de su papel en las células que experimentan la mitosis es limitada, y tal información sobre hongos filamentosos es virtualmente inasequible. Es este entrehierro en conocimiento que los investigadores observaban para dirigir.

En su estudio, los investigadores primero crearon un vector (sistema de envío del gen) basado en CRISPR/Cas9 para confirmar el cruce-tipo hora en la región receptora del gen en el hongo del chorro del arroz.

Entonces, verificar el alcance del gen o la “substitución de la serie,” crearon un vector del “mutante”, optimizado para el único cruce-tipo hora, para la desorganización apuntada del gen del ordenador principal que codifica la dehidratasa del scytalone (SDH), una proteína implicada en la formación de la melanina. Este vector fue introducido en el vector que contenía el gen para el phosphotransferase del hygromycin B (hph), que consulta resistencia al hygromycin antibiótico B. Los investigadores especularon que el único cruce-tipo hora insertaría el vector entero junto con hph en el sitio del objetivo. Los mutantes con el gen roto del SADO serían determinados como colonias blancas (debido a la baja de la melanina) en un hygromycin que contiene mediano B. Los investigadores encontraron que el número de colonias blancas B-resistentes del hygromycin aumentó dramáticamente usando el vector CRISPR/Cas9, así que significa que el sistema CRISPR/Cas9 es efectivo en inducir el único cruce-tipo HORA. La ventaja más grande de esta técnica es que necesita las series homólogas extremadamente cortas (100 pares bajos; cuál es realmente pequeño en biología molecular).

Los investigadores también utilizaron una estrategia similar para verificar si la introducción del gen (o el “pistoneo en”) es posible vía el único cruce-tipo hora usando un vector CRISPR/Cas9. Utilizaron el gen verde-fluorescente (GFP) de la proteína, que es ampliamente utilizado como un gen del “reportero” hacer resplandor de las células huesped verde fluorescente cuando está insertado en su genoma. Especularon que la única cruce hora daría lugar a la introducción de GFP en la serie receptora. De hecho, encontraron que el uso del vector CRISPR/Cas9 dio lugar a colonias fluorescentes verdes en ambiente del hygromycin. Estas conclusión muestran que el sistema CRISPR/Cas9 se puede utilizar para el gen “de un solo paso” eficiente pistoneo-en.

Esta investigación apunta hacia un hecho asombrosamente que, quizás, PAMs no sea todo el que necesario para el gen CRISPR/Cas9 que corrige en hongos. Saludando el éxito de la investigación, los estados de las personas, “hemos encontrado que los hongos filamentosos tienen características genomic únicas, en donde las cruces son inducidas con frecuencia, incluso en células somáticas, hendiendo la DNA del objetivo. Utilizamos estas características para romper la DNA del objetivo y para introducir genes del “reportero”. También tuvimos éxito en el aumento de la eficiencia y de la velocidad del pistoneo-en, usando un proceso de un solo paso. Esta tecnología vence la restricción planteada por PAMs--cuál es una de las desventajas más grandes del sistema CRISPR/Cas9--y habilita un genoma más flexible que corrige, que ha sido difícil en estudios anteriores en hongos filamentosos.”

Finalmente, cuando está preguntado por los usos más amplios de esta investigación, estado del Dr. Arazoe y de profesor Kuwata elocuente:

El hongo del chorro del arroz es un patógeno importante que causa la enfermedad destructiva del arroz, que es la comida de grapa del país. El genoma de CRISPR/Cas9-based que corrige la técnica desarrollada en nuestro estudio puede acelerar la investigación biológica molecular sobre este patógeno, contribuyendo final al suministro de alimentos estable y a la seguridad alimentaria instalación-basada. También, esta técnica es aplicable a otros hongos filamentosos ampliamente utilizados en industria--especialmente en el bioprocessing, la comida, y las industrias de la fermentación.”

Fuente:

Universidad de Tokio de la ciencia

Referencia del gorrón:

Yamato, 2019) únicas substituciones apuntadas cruce-mediadas del nucleótido del T. y otros (y pistoneo-en estrategias con el sistema CRISPR/Cas9 en el hongo del chorro del arroz. Partes científicos. doi.org/10.1038/s41598-019-43913-0.