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a selezione basata FACS di CRISPR mostra come il batterio di clamidia invade le cellule ospiti

I ricercatori alla Harvard University sono un punto più vicino a capire come il batterio di trachomatis di clamidia utilizza il macchinario molecolare delle cellule ospiti per l'invasione. Il gruppo impiegato fluorescenza-ha attivato la selezione (FACS) ordinare ordinare delle cellule CRISPR per l'identificazione di tre geni importanti del candidato conosciuti per facilitare l'invasione patogena.

I trachomatis di clamidia è un microrganismo insidioso che causa la clamidia in esseri umani.Kateryna Kon | Shutterstock

Il batterio dell'obbligazione, trachomatis di clamidia, è un microrganismo insidioso che causa la malattia sessualmente trasmessa, clamidia, in esseri umani.

Le infezioni sono progressive, con i pazienti undiagnosed che hanno un rischio aumentato di cecità, di malattia infiammatoria pelvica e di sterilità. Come tale, una comprensione sviluppata degli eventi molecolari che supportano la patogenesi di trachomatis del C. - specialmente i fattori infezione-permissivi endemici al host umano - presente un viale novello per lo sviluppo di terapeutica.

Le configurazioni di ricerca sugli studi esistenti che hanno messo a fuoco sull'identificazione di fattore ospite del candidato con l'uso di uno strumento genetico, RNAi, in schermi genoma di ampiezza in cellule umane. Questi schermi basati sulla perdita-de-funzione, in cui i geni che codificano i fattori sono diminuiti o si eliminano.

L'arrivo di CRISPR/Cas9 che modifica la tecnologia da allora ha fornito un nuovo e metodo migliore di conduzione degli schermi genoma di ampiezza di perdita-de-funzione.

I risultati erano inattesi

La sosta ed i colleghi hanno confermato la ricerca precedente che dimostra quella più di 50% del candidato che i geni sono quelli implicati nella sintesi del solfato di heparan, dimostrante il ruolo del solfato di heparan in collegamento di trachomatis del C. alle cellule ospiti.

Il gruppo ulteriore descrive il ruolo di un candidato insospettato; COPI - un complesso della proteina che è descritto qui sotto. La ricerca precedente non è riuscito a dimostrare un ruolo per COPI in patogenesi.

Il gruppo di ricerca dal laboratorio di Waldor alla Harvard University ha utilizzato uno schermo ordinare ordinare (FACS) fluorescenza-attivato delle cellule CRISPR delle cellule umane per identificare le proteine ospite che permettono al trattamento di invasione dei trachomatis intracellulari del batterio C.

Il gruppo ha infettato un gruppo di perdita-de-funzione di celle Cas9 con i trachomatis di corrente alternata che esprimono un indicatore fluorescente. Le celle che erano quantità negativa fluorescente dell'indicatore sono state selezionate, come i batteri invadono le celle, oscurando la fluorescenza.

Queste celle sono presunte per essere arricchite per i geni del candidato mentre l'invasione è mediata dai fattori ospite. Gli sgRNAs di queste celle sono stati ordinati ed analizzato stati per significato statistico, rendendo diciassette geni possibili del candidato.

I geni principali responsabili di questi fattori sono stati categorizzati in una codifica principale di tre gruppi:

  1. Gli enzimi biosintetici del solfato glycosaminoglycan di heparan della cella-superficie. Il solfato di Heparan funge da manopola molecolare, posante come ricevitore per l'agente patogeno.
  2. Induttori di actina che ricostruiscono, che facilitano l'invasione di trachomatis del C.
  3. Il complesso I (COPI), che aiuta nella presentazione di biosintesi e della cella-superficie del solfato di heparan, in collegamento dei trachomatis del C. e nello spostamento del suo tipo il sistema della secrezione di III (T3SS) - apparato del coatomer che permette all'iniezione delle proteine dell'effettore nella cellula ospite.

L'identificazione di COPI era considerevole; i ricercatori hanno supposto che la metodologia impiegata negli studi precedenti avesse impedito (quelli con le mutazioni che causano una perdita parziale di funzione del gene) gli alleli hypomorphic rari di COPI essere identificata. L'uso di CRISPR aggira questo, fornire mezzi di arricchimento degli alleli di COPI.

la presentazione Copi-mediata della superficie e/o della sintesi del HS è supposta dai ricercatori per accadere via i meccanismi indiretti che agiscono per alterare il Golgi e la dinamica vescicolare della cella. Quindi, gli agenti patogeni HS-dipendenti sono presunti per possedere una co-dipendenza su COPI per l'invasione. Il HS, mentre il gene di segnatura superiore del candidato non è necessario per i trachomatis infezione del C., suggerente gli itinerari indipendenti da questo proteoglycan egualmente esiste.

Lo studio egualmente dimostra il ruolo di COPI a valle del collegamento alla cellula ospite. Quando i ricercatori hanno usato il golgicide A, che acutamente interrompe COPI, hanno trovato quello spostamento della tela cerata, un effettore che la proteina che stimola i trachomatis T3SS del C. via la sua attività actina-impacchettante, è diminuita. La sosta et al. suppone che questo difetto nel T3SS risulti dalle alterazioni in composizione lipidica della membrana che limitano la sua funzione.

A CRISPR basato FACS stava schermando uno strumento utile?

I ricercatori concludono che la capacità di COPI di suscitare gli effetti multipli, o la sua pleiotropia, nel contesto della posizione COPI di invasione di trachomatis del C. come gene problematico del candidato per la terapia. Ciò è perché un collegamento concreto ai punti nel trattamento di invasione dell'agente patogeno è difficile da stabilire. Come tale, gli autori aggettano la necessità per le nuove strategie della perturbazione della proteina di facilitare la comprensione dei ruoli di tutti i geni nell'infezione dell'agente patogeno.

Ciò nonostante, gli autori hanno dimostrato con successo l'utilità alla della selezione basata FACS di CRISPR nell'identificazione l'identità e del ruolo meccanicistico dei fattori ospite che contribuiscono all'invasione patogena. Nelle parole della sosta et al. “i nostri risultati mostrano ancora una volta l'utilità di usando gli agenti patogeni intracellulari come sonde per delucidare la biologia cellulare ospite„.

Journal reference:

Park et al. (2019) A FACS-Based Genome-wide CRISPR Screen Reveals a Requirement for COPI in Chlamydia trachomatis Invasion. Cell https://doi.org/10.1016/j.isci.2018.12.011

Hidaya Aliouche

Written by

Hidaya Aliouche

Hidaya is a science communications enthusiast who has recently graduated and is embarking on a career in the science and medical copywriting. She has a B.Sc. in Biochemistry from The University of Manchester. She is passionate about writing and is particularly interested in microbiology, immunology, and biochemistry.

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