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a selecção FACS-baseada de CRISPR mostra como a bactéria da clamídia invade pilhas de anfitrião

Os pesquisadores na Universidade de Harvard são uma etapa mais perto de compreender como a bactéria dos trachomatis da clamídia usa a maquinaria molecular de pilhas de anfitrião para a invasão. A equipe empregada fluorescência-activou a selecção (FACS) classificar-baseada pilha de CRISPR para a identificação de três genes principais do candidato conhecidos para facilitar a invasão patogénico.

Os trachomatis da clamídia são um micro-organismo insidioso que cause a clamídia nos seres humanos.Kateryna Kon | Shutterstock

A bactéria da obrigação, trachomatis da clamídia, é um micro-organismo insidioso que cause a doença de transmissão sexual, clamídia, nos seres humanos.

As infecções são progressivas, com os pacientes undiagnosed que têm um risco aumentado de cegueira, de doença inflamatório pélvica e de infertilidade. Como tal, uma compreensão desenvolvida dos eventos moleculars que apoiam a patogénese dos trachomatis do C. - particularmente os factores infecção-permissivos endémicos ao anfitrião humano - presentes uma avenida nova para a revelação da terapêutica.

As construções da pesquisa nos estudos existentes que se centraram sobre a identificação do factor do anfitrião do candidato com o emprego de uma ferramenta genética, RNAi, em telas genoma-largas em pilhas humanas. Estas telas baseadas na perda--função, em que os genes que codificam factores são reduzidos ou eliminados.

O advento de CRISPR/Cas9 que edita a tecnologia tem fornecido desde um método novo e melhorado de conduzir telas genoma-largas da perda--função.

Os resultados eram inesperados

O parque e os colegas corroboraram a pesquisa precedente que demonstra aquela sobre 50% do candidato que os genes são aqueles implicados na síntese do sulfato do heparan, demonstrando o papel do sulfato do heparan no acessório dos trachomatis do C. às pilhas de anfitrião.

A equipe mais adicional descreve o papel de um candidato insuspeito; COPI - um complexo da proteína que seja descrito abaixo. A pesquisa precedente não demonstrou um papel para COPI na patogénese.

A equipa de investigação do laboratório de Waldor na Universidade de Harvard usou uma tela classificar-baseada (FACS) pilha fluorescência-ativada de CRISPR de pilhas humanas para identificar as proteínas do anfitrião que permitem o processo da invasão dos trachomatis intracelulares da bactéria C.

A equipe contaminou uma associação da perda--função das pilhas Cas9 com os trachomatis da corrente alternada que expressam um marcador fluorescente. As pilhas que eram negativo fluorescente do marcador foram seleccionadas, como as bactérias invadem as pilhas, obscurecendo a fluorescência.

Estas pilhas estão presumidas ser enriquecidas para os genes do candidato enquanto a invasão é negociada por factores do anfitrião. Os sgRNAs destas pilhas foram arranjados em seqüência e analisados para o significado estatístico, rendendo dezessete genes possíveis do candidato.

Os genes principais responsáveis para estes factores foram categorizados em uma codificação principal de três grupos:

  1. As enzimas biossintéticas do sulfato glycosaminoglycan do heparan da pilha-superfície. O sulfato de Heparan actua como um punho molecular, levantando como um receptor para o micróbio patogénico.
  2. Indutor do actínio que remodelam, que facilitam a invasão dos trachomatis do C.
  3. O complexo do coatomer mim (COPI), que ajuda na apresentação da biosíntese e da pilha-superfície do sulfato do heparan, no acessório dos trachomatis do C., e na translocação de seu tipo sistema da secreção de III (T3SS) - instrumento que permite a injecção de proteínas do effector na pilha de anfitrião.

A identificação de COPI era notável; os pesquisadores supor que a metodologia empregada em estudos precedentes impediria que (aqueles com mutações que causam uma perda parcial de função do gene) os alelos hypomorphic raros de COPI estejam identificados. O uso de CRISPR contorna este, fornecer meios de enriquecer os alelos de COPI.

a apresentação Copi-negociada da síntese e/ou da superfície do HS é supor pelos pesquisadores para ocorrer através dos mecanismos indirectos que actuam para alterar o Golgi e a dinâmica vesicular da pilha. Assim, os micróbios patogénicos HS-dependentes são presumidos possuir uma co-dependência em COPI para a invasão. O HS, enquanto o gene marcando superior do candidato não é necessário para trachomatis infecção do C., sugerindo o independente das rotas deste proteoglycan igualmente existe.

O estudo igualmente demonstra o papel de COPI rio abaixo do acessório à pilha de anfitrião. Quando os pesquisadores usaram o golgicide A, que interrompe aguda COPI, encontraram essa translocação do encerado, um effector que a proteína que estimula os trachomatis T3SS do C. através de sua actividade deempacotamento, é reduzida. O parque supor e outros que este defeito no T3SS elevara das alterações na composição de lipido da membrana que limitam sua função.

CRISPR FACS-baseado seleccionava uma ferramenta útil?

Os pesquisadores concluem que a capacidade de COPI para induzir efeitos múltiplos, ou sua pleiotropia, no contexto da posição COPI da invasão dos trachomatis do C. como um gene problemático do candidato para a terapia. Isto é porque uma relação concreta às etapas no processo da invasão do micróbio patogénico é difícil de estabelecer. Como tal, os autores projectam a necessidade para que as estratégias novas da perturbação da proteína facilitem a compreensão dos papéis de todos os genes na infecção do micróbio patogénico.

Todavia, os autores demonstraram com sucesso o serviço público da selecção FACS-baseada de CRISPR em identificar a identidade e o papel mecanicista dos factores do anfitrião que contribuem à invasão patogénico. Nas palavras do parque e outros “nossos resultados mostram mais uma vez o serviço público de usar os micróbios patogénicos intracelulares como pontas de prova para explicar a biologia celular do anfitrião”.

Journal reference:

Park et al. (2019) A FACS-Based Genome-wide CRISPR Screen Reveals a Requirement for COPI in Chlamydia trachomatis Invasion. Cell https://doi.org/10.1016/j.isci.2018.12.011

Hidaya Aliouche

Written by

Hidaya Aliouche

Hidaya is a science communications enthusiast who has recently graduated and is embarking on a career in the science and medical copywriting. She has a B.Sc. in Biochemistry from The University of Manchester. She is passionate about writing and is particularly interested in microbiology, immunology, and biochemistry.

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