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Utilisant la dispersion de la lumière pour caractériser des interactions acides Protéine-Nucléiques


insights from industryDr Sophia Kenrick Director of Analytical Services Wyatt Technology
Armant les interactions entre l'ADN, l'ARN, et les prises de protéines beaucoup de promesse pour trouver des biomarqueurs, diagnostiquer la maladie, et s'améliorer cancer-visant la thérapeutique. La mesure de ces interactions est essentielle pour comprendre et régler leurs mécanismes biomoléculaires.

la dispersion de la lumière de Multi-cornière (MALS) est un puissant outil pour mesurer directement les masses molaires des protéines, des acides nucléiques, et des composés en solution sans fluorescent ou radio-marquage.

Dans cette entrevue, M. Sophia Kenrick parle aux sciences de la vie Nouvelles-Médicales environ deux techniques complémentaires de lumière-dispersion, à la chromatographie de taille-exclusion ajoutées à la dispersion de la lumière de multi-cornière (MALS) et au composition-gradient MALS qui fournissent des outils de caractérisation pour analyser les acides nucléiques et les interactions entre les acides nucléiques et les protéines.

Pouvez-vous expliquer l'importance d'étudier des interactions acides protéine-nucléiques ?

Le biotherapeutics étant développé aujourd'hui pour la demande de règlement de nombreux troubles sont basés sur un large éventail de biopolymères. Type, le biotherapeutics étaient les anticorps conçus, mais maintenant toutes sortes de biopolymères sont employées pour produire les agents thérapeutiques. Le biotherapeutics d'ADN et basé sur ARNs deviennent de plus en plus répandu comme immunothérapies du cancer et vaccins de cancer.  

L'efficacité de telles demandes de règlement dépend de l'ARN étant livré aux cellules immunitaires et les transformant en agents de tumeur-désignation d'objectifs. L'aspect de la distribution est essentiel à son efficacité. Il est pour cette raison important que nous comprennions les propriétés des biopolymères étant employés et comment ils agissent l'un sur l'autre avec d'autres composés biologiques afin de les rendre aussi efficaces comme possible. La caractérisation biophysique est ainsi essentielle. Par exemple, le rendement de la distribution pourrait dépendre de combien de polymère est conjugué à votre ARN ou le procédé de purification peut faire former votre ARN monocatenaire les duplex que vous ne voulez pas.

La caractérisation des interactions entre les acides nucléiques et les protéines d'hôte ou d'autres molécules est également critique à comprendre la biologie fondamentale des conditions saines et de la maladie. Obtenant les informations détaillées au sujet de la façon dont le grippage de ces molécules nous aide à comprendre des relations de structure/fonctionnement et avise le développement des biocapteurs sensibles ou de haut-affinité.

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Comment la dispersion de la lumière peut-elle être employée pour caractériser de telles interactions ?

Les études de dispersion de la lumière peuvent fournir l'information clés au sujet de la taille, de la masse molaire, et de la conformation de ces composés. La masse molaire des molécules et la force des interactions avec leurs ligands obligatoires peuvent être directement mesurées sans besoin de marquage ou de normes de masse molaires. Ceci réduit le risque de corps étrangers.

Il y a plusieurs voies que des techniques de dispersion de la lumière peuvent être appliquées à la caractérisation d'ADN et d'ARN. MALS, la dispersion de la lumière dynamique, et la dispersion de la lumière électrophorétique peuvent tout être employés pour caractériser les propriétés physiques, telles que la taille, le poids moléculaire, et la charge.

Lesquelles des techniques de dispersion de la lumière ont été employées dans les études de cas ?

Les deux études de cas emploient la dispersion de la lumière de multi-cornière ou le MALS. Quand un laser est dirigé à une solution, la plupart des passages légers complètement, mais certains de la lumière est dispersé dans tous les sens par les molécules qui sont dans la solution. L'intensité de la lumière dispersée est proportionnelle à la masse molaire, la concentration, et l'échelon d'indice de réfraction, ou dn/dc. Ainsi, en mesurant l'intensité de dispersion de la lumière vous pouvez directement prévoir la masse molaire de ces molécules en solution.

La dispersion de la lumière est mesurée aux cornières multiples simultanément. C'est tout importante que la variation de la cornière de dispersion est proportionnelle à la taille de cette molécule et peut être employée pour déterminer le radius d'une molécule ou d'une particule, et c'est critique pour de plus grandes molécules de compréhension d'ADN et d'ARNm.

La première étude de cas montre l'utilisation de MALS avec la chromatographie d'exclusion de taille (SEC-MALS) en caractérisant le composé de l'ADN et de la protéine en analysant chacune de la substance actuelle dans une solution. La deuxième étude de cas emploie CG-MALS pour mesurer directement l'affinité obligatoire et la stoechiométrie du composé en solution.

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Comment SEC-MALS est-il employé dans l'étude des composés biologiques ?

Parfois, même lorsqu'une séparation de CLHP ou d'UHPLC est idéale, la masse molaire de l'échantillon a estimé que juste basé le temps d'élution n'apparie pas la masse molaire de la norme. Ce mésappariement peut surgir quand l'échantillon et la norme ont une densité différente et une conformation différente.

Dans SEC-MALS l'effluent flux de CLHP ou d'UHPLC de fléau dans un détecteur UV, notre détecteur de dispersion de la lumière de multi-cornière, et un détecteur de l'indice de réfraction (RI). L'UV ou le détecteur de RI fournit la mesure de concentration, qui est employée avec les caractéristiques d'intensité de MALS pour prévoir véritable Massachusetts de molaire. La mesure de MALS confirme également que la solution a été complet séparée en indiquant si les crêtes sont uniformes en termes de masse molaire, ou hétérogène.

Cette analyse n'est pas comme simple pour un composé se composant de deux types différents de molécules. Chaque composante a un coefficient d'extinction différent et un dn/dc différent. En pareil cas, nous devons appliquer une « analyse conjuguée de protéine » qui utilise chacun des trois détecteurs déterminent la quantité de chaque composante dans notre composé, directement.

Mesurant la concentration utilisant l'UV et le détecteur de RI, nous donne la fraction de masse et la masse molaire de chaque composante. Il y a des demandes multiples de cette technique, telle que les protéines glycosylées ou pegylated, ou un polysaccharide functionalized avec des peptides ou avec des acides nucléiques. Même des composés non-covalents peuvent être caractérisés, comme la quantité de lipide liée à une protéine de membrane ou, dans nos composés acides protéine-nucléiques de cas.

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Comment est-ce que c'appliqué était dans votre étude de cas de SEC-MALS ?

L'approche conjuguée d'analyse de SEC-MALS et de protéine a été appliquée au composé de l'integrase et de l'ADN viral (PFV) mousseux de virus de prototype, qui est appelé l'intasome.

Le coefficient d'extinction obtenu pour l'integrase de PFV utilisant l'UV et le RI était simultanément presque moitié de ce que nous compterions juste basé sur la séquence, mais en mesurant la masse molaire avec la concentration de RI et la concentration UV confirmez qu'elle est correcte. Déjà, c'est les informations utiles au sujet du composé qui aidera en déterminant Massachusetts de molaire.

Passant à l'intasome, la dispersion de la lumière, les signes d'UV, et de RI ont été utilisés comme moyen de prévoir la masse molaire et les fractions de masse de chaque partie à chaque remarque dans le chromatogramme.

Ceci a prouvé que la fraction de protéine est environ 90%, la signification de 90% de la masse est protéine et environ 10% est ADN. Basé sur cette information, nous avons obtenu le dn/dc pour le coefficient entier complexe et d'extinction pour cela composé entier. Nous avions l'habitude cette concentration et ce dn/dc pour prévoir alors Massachusetts de molaire. Toute la masse molaire était 194 kilodaltons, ainsi nous savons que la pièce de protéine est 174 kilodaltons, et la pièce d'ADN est environ 20 kilodaltons. C'est équivalent à un tétramère de l'integrase et de deux brins d'ADN, qui apparie la structure cristalline.

On l'a observé que la masse molaire n'était pas continuelle en travers de la crête, indiquant que la dissociation du tétramère de protéine a pu s'être produite pendant une séparation ou quelques espèces peuvent ne pas être saturées. La prochaine étude de cas montre comment nous pouvons mesurer ces genres d'affinités et de stoechiométrie en solution.

Ainsi comment CG-MALS diffère-t-il de SEC-MALS ?

CG-MALS est la technique qui laisse mesure américaine l'affinité et la stoechiométrie des composés formant en solution.

À la différence de dans l'étude de cas précédente, MALS est appliqué aux échantillons non fractionnés. Une suite d'échantillons de différentes compositions est injectée dans les détecteurs de dispersion et de concentration de la lumière ainsi nous pouvons employer MALS pour déterminer la masse molaire à chaque composition. Le changement de la masse molaire peut alors être lié à la formation des composés en solution.

De cette façon, nous pouvons évaluer l'auto-association et l'équilibre entre le monomère et le dimère et le dimère et le trimère. En mesurant la masse molaire en fonction de la concentration, nous pouvons déterminer l'affinité d'auto-association et la stoechiométrie.

Si composé ne forme pas, la masse molaire restera continuelle en fonction de la concentration. Car les composés aiment des dimères et les trimères forment, nous voyons une augmentation de la masse molaire en fonction de la concentration. Utilisant un modèle approprié, nous pouvons adapter cette augmentation pour nous dire l'affinité et la stoechiométrie de l'association.

La même technique peut être appliquée à une interaction entre deux espèces différentes. La composition comprend juste des concentrations variables des deux substances. Nous obtenons des mesures quand chacune de la substance est supérieure ainsi nous pouvons échantillonner la stoechiométrie entière de cette interaction.

Comme les composés forment, la masse molaire des augmentations de cette solution donnant une courbure caractéristique. Plus grippent composés, plus l'interaction est intense. Ceci effectue le plus élevé maximal et plus pointu.

En outre, la position de la crête nous indique au sujet de la stoechiométrie de la solution. Si la substance B a un accepteur pour la substance A, nous verrons l'apex maximal au rapport de molaire de 1:1. Si chaque B peut gripper deux molécules d'A, nous verrons le maximum au rapport molaire de 2:1 et ainsi de suite.

En outre, depuis la technique de CG-MAL mesure la masse molaire directement, nous pouvons faire la différence par exemple entre un 1:1 et une interaction de 2:2. Ils les deux atteindront un maximum à la même position, mais nous pouvons encore différencier car le composé de 2:2 aura deux fois Massachusetts de molaire.

Quel composé a été étudié utilisant CG-MALS dans votre deuxième étude de cas ?

CG-MALS a été employé pour vérifier un recombinase de Cre dans le composé avec un site de reconnaissance du loxP ADN.

Premièrement, nous avions l'habitude un gradient de concentration du Cre pour mesurer la masse molaire de cette seule protéine et pour déterminer s'il des auto-associés. Un test assimilé a été effectué pour l'ADN par lui-même. Des mesures de MALS ont été prises pour chaque molécule à cinq concentrations différentes.

La masse molaire de chaque molécule n'a pas augmenté en travers de la gamme de concentration, prouvant qu'ils auto-n'associent pas du tout. Le Cre a donné une masse molaire continuelle de 39 kilodaltons, qui est compatible avec du monomère, et la masse molaire d'ADN a mesuré un kilodalton de la constante 23, qui est également le monomère.

L'association entre l'enzyme et l'ADN a été alors étudiée. Des mélanges de la protéine et l'ADN à 13 concentrations différentes se sont analysés dans le MALS circulent cellule. L'augmentation de l'intensité de dispersion de la lumière était proportionnelle à l'augmentation de la masse molaire au fil du temps, car les composés de Cre/loxP ont été formés.

La masse molaire à l'équilibre s'est avérée environ 110 kilodaltons. Ceci nous a immédiatement indiqué que la stoechiométrie est plus grande que le 1:1 car 39 plus 23 est seulement 62.

La crête était en bonne position pour un 2:1 grippant le rapport, mais la masse molaire était encore plus grande qu'elle devrait être pour un tel composé, proposant que quelques structures évoluées soient formées plutôt qu'un 1:1 ou un composé normal de 2:1. Ceci a été supporté par la courbure aux rapports élevés d'ADN à une protéine qui n'est pas captée par un modèle simple de 2:1.

La mesure des masses molaires a prouvé qu'il y avait réellement trois composés différents. Le premier est un Cre lié aux protéines à l'ADN, et ce premier grippement se produit avec une constante de dissociation d'équilibre de 170 nanomolar.

Un deuxième Cre grippe alors à ce composé d'une façon coopérative. Une fois qu'une protéine de Cre est liée à l'ADN l'affinité pour le second augmente. En conclusion, ce hétéro-tétramère de Cre-loxP dimerizes avec une affinité de 400 nanomolar.

Les concentrations les explorant en expérience unique de CG-MALS juste de quelques centx nanomolar pour chaque substance nous ont ainsi permises de décrire ce mécanisme de liaison en trois étapes amplement.

Il n'était pas nécessaire de fonctionner dans des régimes multiples de concentration ou de supposer qu'un ou plusieurs de ces accepteurs est entièrement saturé, ou qu'une part de cette réaction est négligeable. Vous pouvez obtenir la caractérisation et la mesure complètes la totalité avec juste une expérience unique.

Non seulement obtenez-vous l'affinité et la stoechiométrie, mais CG-MALS te donne également la composition de la solution pour chaque mélange.

 

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Pouvez-vous nous donner un bref résumé des deux études de cas ?

Oui, si tout va bien, j'ai également montré cette dispersion de la lumière, ou avec le fractionnement ou par lots, n'est pas simplement pour des protéines. Ces mêmes analyses sont critiques pour l'ADN et l'ARN, et pour caractériser les acides nucléiques dans le composé avec d'autres molécules.

Les deux études de cas ont mis en valeur deux genres différents de caractérisations qui peuvent être obtenues pour les systèmes assimilés de protein/DNA utilisant MALS.

SEC-MALS avec l'analyse de conjugué de protéine nous a donné la masse molaire absolue et la protéine et la fraction d'ADN pour un integrase viral bondissent à son ligand d'ADN. Ceci a été fait sans normes de masse molaires et sans assumer n'importe quoi au sujet de la stoechiométrie.

CG-MALS par lots sans chromatographie nous laisse mesurer l'affinité et la stoechiométrie de cela complexe dans une interaction multipas de protein/DNA. L'analyse de l'interaction n'exige pas le marquage ou l'immobilisation.  

Où peuvent nos lecteurs aller découvrir plus ?

Pour découvrir plus, visitez s'il vous plaît notre site Web - www.wyatt.com/SEC-MALS et www.wyatt.com/CG-MALS.

Au sujet de Sophia Kenrick

M. Sophia Kenrick est un scientifique supérieur d'application à la technologie de Wyatt où il supporte des demandes multiples d'instrumentation de Wyatt, particulièrement dans le domaine de la reconnaissance moléculaire et des interactions biomoléculaires.

Sophia sert en tant que directeur des services analytiques et de doyen d'université de dispersion de la lumière, campus de Santa Barbara.

Citations

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