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Facendo uso dello scattering leggero per caratterizzare le interazioni acide Proteina-Nucleiche


insights from industryDr Sophia Kenrick Director of Analytical Services Wyatt Technology
Sfruttando le interazioni fra DNA, RNA e le tenute delle proteine molta promessa per la rilevazione dei biomarcatori, la diagnostica della malattia e migliorare Cancro-mirando alla terapeutica. La misura delle queste interazioni è essenziale per la comprensione e gestire dei loro meccanismi biomolecolari.

lo scattering leggero di Multi-angolo (MALS) è uno strumento potente per direttamente la misurazione delle masse molari delle proteine, degli acidi nucleici e dei complessi in soluzione senza fluorescente o radio-contrassegnare.

In questa intervista, il Dott. Sophia Kenrick parla con scienze biologiche Notizia-Mediche circa due tecniche complementari di luminoso scattering, cromatografia di dimensione-esclusione accoppiate con lo scattering dell'indicatore luminoso di multi-angolo (MALS) e composizione-gradiente MALLES VENOSTA che forniscono gli strumenti di caratterizzazione per analizzare gli acidi nucleici e le interazioni fra gli acidi nucleici e le proteine.

Potete spiegare l'importanza di studio delle interazioni acide proteina-nucleiche?

Il biotherapeutics che è diventato oggi per il trattamento di numerosi disordini è basato su una vasta gamma di biopolimeri. Tipicamente, il biotherapeutics era anticorpi costruiti, ma ora tutti i tipi di biopolimeri stanno usandi per produrre gli agenti terapeutici. Il DNA e a biotherapeutics basato a RNA stanno diventando sempre più prevalente come le immunoterapie del cancro e vaccini del cancro.  

L'efficacia di tali trattamenti dipende da RNA che è consegnato alle celle immuni e trasformandole negli agenti d'ottimizzazione. L'aspetto della consegna è determinante per la sua efficacia. È quindi importante che capiamo i beni dei biopolimeri che sono usando e come interagiscono con altri composti biologici per renderli efficaci come possibile. La caratterizzazione biofisica è così essenziale. Per esempio, il risparmio di temi della consegna potrebbe dipendere da quanto polimero è coniugato al vostro RNA o il trattamento di depurazione può indurre il vostro RNA unico incagliato a formare i duplex che non volete.

La caratterizzazione delle interazioni fra gli acidi nucleici e proteine ospite o altre molecole è egualmente critica a capire la biologia di fondo sia degli stati di malattia che sani. Ottenere l'informazione dettagliata circa come queste molecole legano le guide che noi capiamo le relazioni funzione/della struttura ed informa lo sviluppo dei biosensori di alto-affinità o sensibili.

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Come può accendere lo scattering essere usato per caratterizzare tali interazioni?

Gli studi leggeri di scattering possono fornire informazioni chiave sulla dimensione, sulla massa molare e sulla conformazione di questi complessi. Sia la massa molare delle molecole che la resistenza delle interazioni con i loro leganti obbligatori possono direttamente essere misurate senza l'esigenza del contrassegno o degli standard di massa molari. Ciò diminuisce il rischio di artefatti.

Ci sono parecchi modi che le tecniche di scattering dell'indicatore luminoso possono applicarsi alla caratterizzazione del RNA e del DNA. MALLES VENOSTA, lo scattering leggero dinamico e lo scattering leggero elettroforetico possono tutti essere usati per caratterizzare le proprietà fisiche, quali la dimensione, il peso molecolare e la tassa.

Quale delle tecniche leggere di scattering sono state utilizzate negli studi finalizzati?

Entrambi gli studi finalizzati usano lo scattering leggero o MALLES VENOSTA di multi-angolo. Quando un laser è diretto completamente ad una soluzione, la maggior parte dei passaggi leggeri, ma alcune dell'indicatore luminoso è sparso in tutte le direzioni dalle molecole che sono nella soluzione. L'intensità dell'indicatore luminoso sparso è proporzionale alla massa molare, la concentrazione e l'incremento di indice di rifrazione, o dn/dc. Così, misurando l'intensità leggera di scattering potete direttamente calcolare la massa molare di quelle molecole in soluzione.

Lo scattering leggero è misurato simultaneamente agli angoli multipli. Ciò è per quanto la variazione nell'angolo di scattering sia importante proporzionale alla dimensione di quella molecola e può essere usata per determinare il raggio di una molecola o di una particella e questa è critica per le molecole più grandi di comprensione del mRNA e del DNA.

Il primo studio finalizzato mostra l'uso di MALLES VENOSTA con la cromatografia di esclusione di dimensione (SEC-MALS) nella caratterizzazione del complesso di DNA e di proteina analizzando ciascuna delle specie presenti in una soluzione. Il secondo studio finalizzato usa CG-MALS direttamente per misurare l'affinità obbligatoria e la stechiometria del complesso in soluzione.

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Come SEC-MALS è utilizzato nello studio sui complessi biologici?

A volte, anche quando una separazione di UHPLC o di HPLC è ideale, la massa molare del campione ha stimato che basato appena sul tempo dell'eluizione non abbinasse la massa molare dello standard. Questo disadattamento può sorgere quando il campione e lo standard hanno una densità differente e una conformazione differente.

In SEC-MALS la corrente fluida da una colonna di UHPLC o di HPLC sfocia in un rivelatore UV, il nostro rivelatore di scattering dell'indicatore luminoso di multi-angolo e un rivelatore di indice di rifrazione (RI). Il rivelatore di RI o UV fornisce la misura di concentrazione, che è usata con i dati dell'intensità di MALLES VENOSTA per calcolare il vero Massachusetts del molare. La misura di MALLES VENOSTA egualmente conferma che la soluzione completamente è stata separata rivelando se i picchi sono costanti in termini di massa molare, o eterogeneo.

Questa analisi non è come semplice per un complesso che consiste di due tipi differenti di molecole. Ogni componente ha un coefficiente di estinzione differente e un dn/dc differente. In tali casi, dobbiamo applicare “un'analisi coniugata della proteina„ che impiega tutti e tre i rivelatori determina la quantità di ogni componente nel nostro complesso, direttamente.

Misurando la concentrazione facendo uso sia del rivelatore di RI che UV, ci dà la frazione di massa e la massa molare di ogni componente. C'è domande multiple di questa tecnica, quali le proteine glicosilate o pegylated, o un polisaccaride functionalized con i peptidi o con gli acidi nucleici. Anche i complessi non covalenti possono essere caratterizzati, quale la quantità di lipido connessa con una proteina della membrana o, nei nostri complessi acidi proteina-nucleici di caso.

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Come era questo applicato nel vostro SEC-MALS studio finalizzato?

L'approccio coniugato dell'analisi della proteina e di SEC-MALS si è applicato al complesso del integrase spumoso del virus (PFV) del prototipo e del DNA virale, che è chiamato il intasome.

Il coefficiente di estinzione ottenuto per il integrase di PFV facendo uso di UV e del RI era simultaneamente quasi metà di cui avremmo preveduto basato appena sulla sequenza, ma misurando la massa molare sia con la concentrazione di RI che la concentrazione UV confermi che è corretta. Già, questa è informazioni utili circa il complesso che aiuterà nella determinazione del Massachusetts del molare.

Passando verso il intasome, lo scattering leggero, i segnali di RI ed e UV sono stati usati calcolare la massa molare e le frazioni di massa di ogni parte ad ogni punto nel cromatogramma.

Ciò ha indicato che la frazione della proteina è circa 90%, significare 90% della massa è proteina e circa 10% è DNA. Sulla base di questi informazioni, abbiamo ottenuto il dn/dc per l'intero coefficiente di estinzione e complesso per quella intero complesso. Abbiamo usato questa concentrazione e questo dn/dc poi per calcolare il Massachusetts del molare. La massa molare totale era 194 kilodaltons, in modo da sappiamo che la parte della proteina è 174 kilodaltons e la parte del DNA è circa 20 kilodaltons. Ciò è equivalente ad un tetramero del integrase e di due fili del DNA, che abbina il sistema cristallino.

È stato osservato che la massa molare non era costante attraverso il picco, indicante che la dissociazione del tetramero della proteina può accadere durante la separazione o alcune specie non possono essere saturate. Lo studio finalizzato seguente mostra come possiamo misurare questi generi di affinità e di stechiometria in soluzione.

Così come CG-MALS differisce da SEC-MALS?

CG-MALS è la tecnica che lascia misura USA l'affinità e la stechiometria dei complessi che si formano in soluzione.

A differenza nello studio finalizzato precedente, MALLES VENOSTA si applica ai campioni non frazionati. Una serie di campioni delle composizioni differenti è iniettata nei rivelatori leggeri di concentrazione e di scattering in modo da possiamo usare MALLES VENOSTA per determinare la massa molare ad ogni composizione. Il cambiamento nella massa molare può poi essere collegato con la formazione di complessi in soluzione.

In questo modo, possiamo valutare l'autoassociazione e l'equilibrio fra il monomero e dimero e dimero e trimero. Misurando la massa molare in funzione di concentrazione, possiamo determinare l'affinità dell'autoassociazione e la stechiometria.

Se nessun complesso si forma, la massa molare resterà costante in funzione di concentrazione. Poichè i complessi gradiscono i dimeri ed i trimeri si formano, vediamo un aumento nella massa molare in funzione di concentrazione. Facendo uso di un modello appropriato, possiamo misura questo aumento per dirci l'affinità e la stechiometria dell'associazione.

La stessa tecnica può applicarsi ad un'interazione fra due specie differenti. La composizione comprende appena le concentrazioni varianti di entrambe le specie. Otteniamo le misure quando ciascuna delle specie è superiore in modo da possiamo campionare l'intera stechiometria di quell'interazione.

Come i complessi si formano, la massa molare degli aumenti di quella soluzione che danno una curva caratteristica. Più complessi lega, più forte l'interazione. Ciò fa il più alto di punta e più marcato.

Inoltre, la posizione del picco ci dice circa la stechiometria della soluzione. Se le specie B ha una sede del legame per le specie A, vederemo la punta di punta al rapporto del molare di 1:1. Se ogni B può legare due molecole di A, vederemo il massimo al rapporto molare di 2:1 ecc.

Inoltre, dalla tecnica di CG-MAL misura direttamente la massa molare, possiamo dire la differenza per esempio fra un 1:1 e un'interazione di 2:2. Entrambi raggiungeranno un massimo alla stessa posizione, ma possiamo ancora differenziarci poichè il complesso di 2:2 avrà due volte il Massachusetts del molare.

Quale complesso è stato studiato facendo uso di CG-MALS nel vostro secondo studio finalizzato?

CG-MALS è stato usato per studiare un recombinase di Cre nel complesso con un sito di riconoscimento del DNA del loxP.

In primo luogo, abbiamo usato un gradiente di concentrazione del Cre per misurare la massa molare di quella proteina da solo e per determinare se auto-soci. Una simile prova è stata effettuata per il DNA da sè. Le misure di MALLES VENOSTA sono state catturate per ogni molecola a cinque concentrazioni differenti.

La massa molare di ogni molecola non è aumentato attraverso l'intervallo di concentrazione, indicante che auto-non stanno associando affatto. Il Cre ha dato la massa molare costante di 39 kilodaltons, che è coerente con un monomero e la massa molare del DNA ha misurato un kilodalton di costante 23, che è egualmente il monomero.

L'associazione fra l'enzima ed il DNA poi è stata studiata. Le miscele della proteina e del DNA a 13 concentrazioni differenti sono state analizzate nella cella di flusso di MALLES VENOSTA. L'aumento nell'intensità leggera di scattering era col passare del tempo proporzionale all'aumento nella massa molare, poichè i complessi di Cre/loxP sono stati formati.

La massa molare ad equilibrio è stata trovata per essere intorno 110 kilodaltons. Ciò immediatamente ci ha detto che la stechiometria è maggior del 1:1 poichè 39 più 23 sono soltanto 62.

Il picco era nella giusta posizione per un 2:1 che lega il rapporto, ma la massa molare era ancora maggior di dovrebbe essere per un tal complesso, suggerendo che alcune strutture di ordine superiore stiano formande piuttosto che un 1:1 o un complesso standard di 2:1. Ciò è stata supportata dalla curvatura agli alti rapporti di DNA ad una proteina che non sta catturanda da un modello semplice di 2:1.

La misura delle masse molari ha indicato che c'erano realmente tre complessi differenti. Quello primo è un Cre legato alle proteine al DNA e questa prima associazione si presenta con una costante di dissociazione di equilibrio di 170 nanomolar.

Un secondo Cre poi lega a questo complesso in un modo cooperativo. Una volta che una proteina di Cre è limitata al DNA l'affinità per quella seconda aumenta. Per concludere, questo etero-tetramero di Cre-loxP dimerizes con un'affinità di 400 nanomolar.

Le concentrazioni d'esplorazione in un singolo esperimento di CG-MALS di appena alcuni cento nanomolar per l'ogni specie ci hanno permesso così di descrivere questo meccanismo di legatura in tre tappe ampiamente.

Non era necessario da lavorare nei regimi multipli di concentrazione o da supporre che uno o più di queste sedi del legame completamente sono saturate, o che una parte di questa reazione è trascurabile. Potete ottenere la caratterizzazione completa e misurare tutto il con appena un singolo esperimento.

Non solo ottenete l'affinità e la stechiometria, ma CG-MALS egualmente vi dà la composizione della soluzione per ogni miscela.

 

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Potete farci un breve resoconto dei due studi finalizzati?

Sì, eventualmente, egualmente ho indicato quello scattering leggero, o con il frazionamento o in lotti, non è appena per le proteine. Queste stesse analisi sono critiche per DNA e RNA e per la caratterizzazione degli acidi nucleici nel complesso con altre molecole.

I due studi finalizzati hanno evidenziato due generi differenti di caratterizzazioni che possono essere ottenute per i simili sistemi di protein/DNA facendo uso di MALLES VENOSTA.

SEC-MALS con l'analisi del coniugato della proteina ci ha dato la massa molare assoluta e la proteina e la frazione del DNA per un integrase virale limitano al suo legante del DNA. Ciò è stata fatta a meno degli standard di massa molari e senza presupporre qualche cosa circa la stechiometria.

CG-MALS in lotti senza cromatografia ci lascia quantificare l'affinità e la stechiometria di quella complessa in un'interazione a più gradi di protein/DNA. L'analisi d'interazione non richiede il contrassegno o l'immobilizzazione.  

Dove possono i nostri lettori andare scoprire più?

Per scoprire più, visualizzi prego il nostro sito Web - www.wyatt.com/SEC-MALS e www.wyatt.com/CG-MALS.

Circa Sophia Kenrick

Il Dott. Sophia Kenrick è uno scienziato senior dell'applicazione alla tecnologia di Wyatt dove supporta le domande multiple di strumentazione di Wyatt, particolarmente nel campo del riconoscimento molecolare e delle interazioni biomolecolari.

Sophia servisce come il Direttore dei servizi analitici e da decano dell'università leggera di scattering, città universitaria di Santa Barbara.

Citations

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    Wyatt Technology. (2019, June 26). Facendo uso dello scattering leggero per caratterizzare le interazioni acide Proteina-Nucleiche. News-Medical. Retrieved on May 06, 2021 from https://www.news-medical.net/news/20190626/Using-Light-Scattering-to-Characterize-Protein-Nucleic-Acid-Interactions.aspx.

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