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Usando a dispersão de luz para caracterizar interacções ácidas Proteína-Nucleicas


insights from industryDr Sophia Kenrick Director of Analytical Services Wyatt Technology
Aproveitando as interacções entre o ADN, o RNA, e as posses das proteínas muita promessa para detectar biomarkers, diagnosticar a doença, e melhorá-la cancro-visando a terapêutica. Determinar estas interacções é essencial para compreender e controlar seus mecanismos biomoleculares.

a dispersão de luz do Multi-ângulo (MALS) é uma ferramenta poderosa para directamente medir as massas do molar das proteínas, de ácidos nucleicos, e de complexos na solução sem fluorescente ou rádio-etiquetar.

Nesta entrevista, o Dr. Sophia Kenrick fala às ciências da vida Notícia-Médicas aproximadamente duas técnicas complementares da luz-dispersão, à cromatografia da tamanho-exclusão acopladas com dispersão de luz do multi-ângulo (MALS) e ao composição-inclinação MALS que fornecem ferramentas da caracterização para analisar ácidos nucleicos e as interacções entre ácidos nucleicos e proteínas.

Pode você explicar a importância de estudar interacções ácidas proteína-nucleicas?

O biotherapeutics que está sendo tornado hoje para o tratamento de desordens numerosas é baseado em uma vasta gama de biopolymers. Tipicamente, o biotherapeutics era anticorpos projetados, mas todos os tipos dos biopolymers estão sendo usados agora para produzir agentes terapêuticos. O ADN e biotherapeutics RNA-baseado estão tornando-se cada vez mais predominante como as imunoterapias do cancro e as vacinas do cancro.  

A eficácia de tais tratamentos depende do RNA que está sendo entregado às pilhas imunes e transformando as em agentes deescolha de objectivos. O aspecto da entrega é crucial a sua eficácia. É conseqüentemente importante que nós compreendemos as propriedades dos biopolymers que estão sendo usados e como interagem com outros compostos biológicos a fim os fazer tão eficazes como possível. A caracterização biofísica é assim essencial. Por exemplo, a eficiência da entrega poderia ser dependente de quanto polímero é conjugado a seu RNA ou o processo da purificação pode fazer com que seu RNA único-encalhado forme os duplex que você não quer.

Caracterizar as interacções entre ácidos nucleicos e proteínas do anfitrião ou outras moléculas é igualmente crítica a compreender a biologia subjacente de estados saudáveis e da doença. Obter a informações detalhadas sobre como estas moléculas ligam ajudas que nós compreendem relacionamentos da estrutura/função e informa a revelação de biosensors sensíveis ou da alto-afinidade.

Crédito de imagem: Shutterstock/GiroScience

Como pode a dispersão de luz ser usada para caracterizar tais interacções?

Os estudos da dispersão de luz podem fornecer o informações-chave sobre o tamanho, a massa do molar, e a conformação destes complexos. A massa do molar das moléculas e a força das interacções com suas ligantes obrigatórias podem directamente ser medidas sem a necessidade para a rotulagem ou o molar padrões em massa. Isto reduz o risco de produtos manufacturados.

Há diversas maneiras que as técnicas da dispersão de luz podem ser aplicadas à caracterização do ADN e do RNA. MALS, a dispersão de luz dinâmica, e a dispersão de luz electrophoretic podem tudo ser usados para caracterizar propriedades físicas, tais como o tamanho, o peso molecular, e a carga.

Quais das técnicas da dispersão de luz foram usadas nos estudos de caso?

Ambos os estudos de caso usam a dispersão de luz do multi-ângulo ou o MALS. Quando um laser é dirigido em uma solução, a maioria das passagens claras por completo, mas algumas da luz está dispersado em todos os sentidos pelas moléculas que estão na solução. A intensidade da luz dispersada é proporcional à massa do molar, a concentração, e o incremento do R.I., ou dn/dc. Assim, medindo a intensidade da dispersão de luz você pode directamente calcular a massa do molar daquelas moléculas na solução.

A dispersão de luz é medida em ângulos múltiplos simultaneamente. Isto é por mais importante que a variação no ângulo de dispersão seja proporcional ao tamanho dessa molécula e possa ser usada para determinar o raio de uma molécula ou de uma partícula, e esta é crítica para moléculas maiores compreensivas do ADN e do mRNA.

O primeiro estudo de caso mostra o uso de MALS com cromatografia da exclusão do tamanho (SEC-MALS) em caracterizar o complexo do ADN e da proteína analisando cada um da espécie actual em uma solução. O segundo estudo de caso usa CG-MALS para medir directamente a afinidade obrigatória e a estequiometria do complexo na solução.

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Como SEC-MALS é usado no estudo de complexos biológicos?

Às vezes, mesmo quando uma separação da HPLC ou do UHPLC é ideal, a massa do molar da amostra calculou que apenas baseado no tempo da eluição não combina a massa do molar do padrão. Esta má combinação pode elevarar quando a amostra e o padrão têm uma densidade diferente e uma conformação diferente.

Em SEC-MALS a efluência fluxos de uma coluna da HPLC ou do UHPLC em um detector UV, em nosso detector da dispersão de luz do multi-ângulo, e em um detector do R.I. (RI). O detector UV ou de RI fornece a medida da concentração, que é usada junto com os dados da intensidade de MALS para calcular a massa verdadeira do molar. A medida de MALS igualmente confirma que a solução estêve separada completamente revelando se os picos são uniformes em termos da massa do molar, ou heterogêneo.

Esta análise não é como simples para um complexo que consiste em dois tipos diferentes de moléculas. Cada componente tem um coeficiente de extinção diferente e um dn/dc diferente. Nesses casos, nós precisamos de aplicar “uma análise conjugada proteína” que empregue todos os três detectores determine a quantidade de cada componente em nosso complexo, directamente.

Medindo a concentração usando o detector UV e de RI, dá-nos a fracção em massa e a massa do molar de cada componente. Há uns pedidos múltiplos para esta técnica, tal como proteínas glycosylated ou pegylated, ou um polisacárido functionalized com peptides ou com ácidos nucleicos. Mesmo os complexos não-covalent podem ser caracterizados, como a quantidade de lipido associada com uma proteína da membrana ou, em nossos complexos ácidos proteína-nucleicos do caso.

ImageCredit: Shutterstock/Billionphotos

Como era este aplicado em seu SEC-MALS estudo de caso?

O SEC-MALS e a aproximação conjugada proteína da análise foram aplicados ao complexo do integrase espumoso do vírus (PFV) do protótipo e do ADN viral, que é chamado o intasome.

O coeficiente de extinção obtido para o integrase de PFV usando UV e o RI era simultaneamente quase metade do que nós esperaríamos apenas baseado na seqüência, mas medindo a massa do molar com a concentração de RI e a concentração UV confirme que está correcta. Já, esta é informação útil sobre o complexo que ajudará em determinar a massa do molar.

Movendo-se sobre para o intasome, os sinais da dispersão de luz, os UV, e do RI foram usados calcular a massa do molar e as fracções em massa de cada parte em cada ponto no cromatograma.

Isto mostrou que a fracção da proteína é aproximadamente 90%, significar 90% da massa é proteína e aproximadamente 10% é ADN. Baseado nesta informação, nós obtivemos o dn/dc para o coeficiente inteiro complexo e de extinção para aquela complexo inteiro. Nós usamos esta concentração e este dn/dc para calcular então a massa do molar. A massa total do molar era 194 kilodaltons, assim que nós sabemos que a peça da proteína é 174 kilodaltons, e a peça do ADN é aproximadamente 20 kilodaltons. Isto é equivalente a um tetramer do integrase e de duas costas do ADN, que combina a estrutura de cristal.

Observou-se que a massa do molar não era constante através do pico, indicando que a dissociação do tetramer da proteína pode ter ocorrido durante uma separação ou alguma espécie não pode ser saturada. O estudo de caso seguinte mostra como nós podemos medir estes tipos das afinidaoes e da estequiometria na solução.

Assim como CG-MALS difere de SEC-MALS?

CG-MALS é a técnica que nos deixa medida a afinidade e a estequiometria dos complexos que formam na solução.

Ao contrário no estudo de caso precedente, MALS é aplicado às amostras unfractionated. Uma série de amostras de composições diferentes é injectada nos detectores da dispersão e da concentração de luz assim que nós podemos usar MALS para determinar a massa do molar em cada composição. A mudança na massa do molar pode então ser relacionada à formação de complexos na solução.

Desta maneira, nós podemos avaliar a auto-associação e o equilíbrio entre o monómero e o dímero e o dímero e o trimer. Medindo a massa do molar em função da concentração, nós podemos determinar a afinidade da auto-associação e a estequiometria.

Se nenhum complexo forma, a massa do molar ficará constante em função da concentração. Porque os complexos gostam de dímero e os trimers formam, nós vemos um aumento na massa do molar em função da concentração. Usando um modelo apropriado, nós podemos caber este aumento para dizer-nos a afinidade e a estequiometria da associação.

A mesma técnica pode ser aplicada a uma interacção entre duas espécies diferentes. A composição apenas inclui concentrações de variação de ambas as espécies. Nós obtemos medidas quando cada um da espécie é superior assim que nós podemos provar a estequiometria inteira dessa interacção.

Como os complexos formam, a massa do molar dos aumentos dessa solução que dão uma curva característica. Mais complexos liga, mais forte a interacção. Isto faz o mais alto máximo e mais afiado.

Também, a posição do pico diz-nos sobre a estequiometria da solução. Se a espécie B tem um local obrigatório para a espécie A, nós veremos o vértice máximo na relação do molar do 1:1. Se cada B pode ligar duas moléculas de A, nós veremos o máximo na relação do molar do 2:1 e assim por diante.

Também, desde a técnica de CG-MAL mede a massa do molar directamente, nós podemos dizer a diferença por exemplo entre um 1:1 e uma interacção do 2:2. Ambos alcançarão um máximo na mesma posição, mas nós podemos ainda diferenciar-se porque o complexo do 2:2 terá duas vezes a massa do molar.

Que complexo foi estudado usando CG-MALS em seu segundo estudo de caso?

CG-MALS foi usado para investigar um recombinase de Cre no complexo com um local de reconhecimento do ADN do loxP.

Em primeiro lugar, nós usamos um inclinação de concentração do Cre para medir a massa do molar dessa proteína apenas e para determinar se ele auto-associados. Um teste similar foi conduzido para o ADN por si só. As medidas de MALS foram tomadas para cada molécula em cinco concentrações diferentes.

A massa do molar de cada molécula não aumentou através da escala de concentração, mostrando que auto-não estão associando de todo. O Cre deu uma massa constante do molar de 39 kilodaltons, que fosse consistente com um monómero, e a massa do molar do ADN mediu um kilodalton da constante 23, que fosse igualmente o monómero.

A associação entre a enzima e o ADN foi estudada então. As misturas da proteína e do ADN em 13 concentrações diferentes foram analisadas no MALS fluem pilha. O aumento na intensidade da dispersão de luz era proporcional ao aumento na massa do molar ao longo do tempo, porque os complexos de Cre/loxP foram formados.

A massa do molar no equilíbrio foi encontrada para ser ao redor 110 kilodaltons. Isto disse-nos imediatamente que a estequiometria é maior do que o 1:1 porque 39 mais 23 são somente 62.

O pico estava na posição direita para um 2:1 que liga a relação, mas a massa do molar era ainda maior do que deve ser para tal complexo, sugerindo que algumas estruturas mais altas do pedido estivessem formadas um pouco do que um 1:1 ou um complexo padrão do 2:1. Isto foi apoiado pela curvatura nas relações altas do ADN a uma proteína que não fosse capturada por um modelo simples do 2:1.

A medida das massas do molar mostrou que havia realmente três complexos diferentes. Primeiro é uma proteína de Cre limitada ao ADN, e este primeiro emperramento ocorre com uma constante da dissociação do equilíbrio de 170 nanomolar.

Um segundo Cre liga então a este complexo em uma maneira cooperativa. Uma vez que uma proteína de Cre é limitada ao ADN a afinidade para segunda aumenta. Finalmente, este hetero-tetramer de Cre-loxP dimerizes com uma afinidade de 400 nanomolar.

As concentrações de exploração de uma única experiência de CG-MALS de apenas alguns cem nanomolar para cada espécie permitiram-nos assim de descrever inteiramente este mecanismo obrigatório da três-etapa.

Não era necessário trabalhar em regimes múltiplos da concentração ou supr que uns ou vários destes locais obrigatórios estão saturados inteiramente, ou que de uma parte desta reacção é insignificante. Você pode obter a caracterização completa e medir toda a ela com apenas uma única experiência.

Não somente você obtem a afinidade e a estequiometria, mas CG-MALS igualmente dá-lhe a composição da solução para cada mistura.

 

Crédito de imagem: Shutterstock/UGREEN3S

Pode você dar-nos um breve resumo dos dois estudos de caso?

Sim, esperançosamente, eu igualmente mostrei essa dispersão de luz, com fraccionamento ou no modo de grupo, não sou apenas para proteínas. Estas mesmas análises são críticas para o ADN e o RNA, e para caracterizar ácidos nucleicos no complexo com outras moléculas.

Os dois estudos de caso destacaram dois tipos diferentes das caracterizações que podem ser obtidas para sistemas similares de protein/DNA usando MALS.

SEC-MALS com análise do conjugado da proteína deu-nos a massa absoluta do molar e a proteína e a fracção do ADN para um integrase viral limitam a sua ligante do ADN. Isto foi feito sem padrões em massa do molar e sem supr qualquer coisa sobre a estequiometria.

CG-MALS no modo de grupo sem cromatografia deixa-nos determinar a afinidade e a estequiometria daquela complexa em uma interacção da multi-etapa protein/DNA. A análise da interacção não exige a rotulagem ou a imobilização.  

Onde podem nossos leitores ir encontrar mais?

Para encontrar mais, visite por favor nosso Web site - www.wyatt.com/SEC-MALS e www.wyatt.com/CG-MALS.

Sobre Sophia Kenrick

O Dr. Sophia Kenrick é um cientista superior da aplicação na tecnologia de Wyatt onde apoia pedidos múltiplos para a instrumentação de Wyatt, especialmente no campo do reconhecimento molecular e de interacções biomoleculares.

Sophia serve como o director de serviços analíticos e como o decano da universidade da dispersão de luz, terreno de Santa Barbara.

Citations

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    Wyatt Technology. (2019, June 26). Usando a dispersão de luz para caracterizar interacções ácidas Proteína-Nucleicas. News-Medical. Retrieved on May 14, 2021 from https://www.news-medical.net/news/20190626/Using-Light-Scattering-to-Characterize-Protein-Nucleic-Acid-Interactions.aspx.

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