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Usando la dispersión luminosa para caracterizar acciones recíprocas ácidas Proteína-Nucléicas


insights from industryDr Sophia Kenrick Director of Analytical Services Wyatt Technology
Aprovechando las acciones recíprocas entre la DNA, el ARN, y los asimientos de las proteínas mucha promesa para descubrir biomarkers, diagnosticar enfermedad, y perfeccionar cáncer-apuntando la terapéutica. La cuantificación de estas acciones recíprocas es esencial para entender y controlar sus mecanismos biomoleculares.

la dispersión luminosa del Multi-ángulo (MALS) es una herramienta potente para directamente medir las masas molares de proteínas, de ácidos nucléicos, y de complejos en la solución sin fluorescente o la radio-etiqueta.

En esta entrevista, el Dr. Sophia Kenrick habla con las ciencias de la vida Noticia-Médicas cerca de dos técnicas complementarias el luz-dispersar, la cromatografía de la talla-exclusión acopladas con la dispersión luminosa del multi-ángulo (MALS) y el composición-gradiente MALS que ofrecen las herramientas de la caracterización para analizar los ácidos nucléicos y las acciones recíprocas entre los ácidos nucléicos y las proteínas.

¿Puede usted explicar la importancia de estudiar acciones recíprocas ácidas proteína-nucléicas?

El biotherapeutics que es convertido hoy para el tratamiento de desordenes numerosos se basa en una amplia gama de biopolímeros. Típicamente, el biotherapeutics era anticuerpos dirigidos, pero ahora toda clase de biopolímeros se están utilizando para producir agentes terapéuticos. La DNA y biotherapeutics ARN-basado están llegando a ser cada vez más frecuente como las inmunoterapias del cáncer y vacunas del cáncer.  

La eficacia de tales tratamientos depende del ARN que es entregado a las células inmunes y transformándolas en agentes de tumor-alcance. El aspecto del lanzamiento es crucial a su eficacia. Es por lo tanto importante que entendemos las propiedades de los biopolímeros que son utilizados y cómo obran recíprocamente con otras composiciones biológicas para hacerlas tan efectivas como sea posible. La caracterización biofísica es así esencial. Por ejemplo, la eficiencia del lanzamiento podría ser relacionada en cuánto polímero se conjuga a su ARN o el proceso de la purificación puede hacer su ARN de una sola fila formar los duplex que usted no quiere.

Caracterizar las acciones recíprocas entre los ácidos nucléicos y las proteínas del ordenador principal u otras moléculas es también crítico a entender la biología subyacente de los estados sanos y de la enfermedad. Conseguir la información detallada sobre cómo estas moléculas atan ayudas que entendemos lazos de la estructura/de la función e informa al revelado biosensores sensibles o de la alto-afinidad.

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¿Cómo se puede la dispersión luminosa utilizar para caracterizar tales acciones recíprocas?

Los estudios de la dispersión luminosa pueden ofrecer la información dominante sobre la talla, la masa molar, y la conformación de estos complejos. La masa molar de las moléculas y la fuerza de las acciones recíprocas con sus ligands obligatorios se pueden medir directamente sin la necesidad de la etiqueta o de patrones en masa molares. Esto reduce el riesgo de artefactos.

Hay varias maneras que las técnicas de la dispersión luminosa se pueden aplicar a la caracterización de la DNA y del ARN. MALS, la dispersión luminosa dinámica, y la dispersión luminosa electroforética se pueden todos utilizar para caracterizar propiedades físicas, tales como talla, peso molecular, y carga.

¿Cuáles de las técnicas de la dispersión luminosa fueron utilizadas en los estudios de caso?

Ambos estudios de caso utilizan la dispersión luminosa del multi-ángulo o MALS. Cuando un laser se dirige en una solución, la mayor parte de la luz pasa completamente, pero algo de la luz es dispersada en todas las direcciones por las moléculas que están en la solución. La intensidad de la luz dispersa es proporcional a la masa molar, la concentración, y el incremento del índice de refracción, o dn/dc. Así pues, midiendo la intensidad de la dispersión luminosa usted puede calcular directamente la masa molar de esas moléculas en la solución.

La dispersión luminosa se mide a los ángulos múltiples simultáneamente. Esto es tan importante que la variación en el ángulo que dispersa es proporcional a la talla de esa molécula y se puede utilizar para determinar el radio de una molécula o de una partícula, y esto es crítica para las moléculas más grandes de comprensión de la DNA y del mRNA.

El primer estudio de caso muestra el uso de MALS con la cromatografía de la exclusión de la talla (SEC-MALS) en caracterizar el complejo de la DNA y de la proteína analizando cada uno de la especie presente en una solución. El segundo estudio de caso utiliza CG-MALS para medir directamente la afinidad obligatoria y la estequiometría del complejo en la solución.

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¿Cómo SEC-MALS se utiliza en el estudio de complejos biológicos?

A veces, incluso cuando una separación de la CLAR o de UHPLC es ideal, la masa molar de la muestra estimaba que apenas basado en el tiempo de la elución no iguala la masa molar del patrón. Este desequilibrio de impedancia puede presentarse cuando la muestra y el patrón tienen una diversa densidad y una diversa conformación.

En SEC-MALS el efluente flujos de una olumna de la CLAR o de UHPLC en un detector ULTRAVIOLETA, nuestro detector de la dispersión luminosa del multi-ángulo, y un detector del índice de refracción (RI). De RI el detector ULTRAVIOLETA u ofrece la medición de la concentración, que se utiliza junto con los datos de la intensidad de MALS para calcular el Massachusetts verdadero de la muela. La medición de MALS también confirma que la solución ha sido separada totalmente revelando si los picos son uniformes en términos de masa molar, o heterogéneo.

Este análisis no está como simple para un complejo que consiste en dos diversos tipos de moléculas. Cada componente tiene un diverso coeficiente de extinción y un diverso dn/dc. En estos casos, necesitamos aplicar un “análisis conyugal de la proteína” que emplee los tres detectores determine la cantidad de cada componente en nuestro complejo, directamente.

Midiendo la concentración usando de RI el detector ULTRAVIOLETA y, nos da la fracción en masa y la masa molar de cada componente. Hay usos múltiples para esta técnica, tal como proteínas glycosylated o pegylated, o un polisacárido functionalized con los péptidos o con los ácidos nucléicos. Incluso los complejos no-covalentes se pueden caracterizar, por ejemplo la cantidad de lípido asociada a una proteína de la membrana o, en nuestros complejos ácidos proteína-nucléicos del caso.

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¿Cómo era éste aplicado en su SEC-MALS estudio de caso?

La aproximación conyugal del análisis de SEC-MALS y de la proteína se ha aplicado al complejo del integrase espumoso del virus (PFV) del prototipo y de la DNA viral, que se llama el intasome.

El coeficiente de extinción obtenido para el integrase de PFV usando ULTRAVIOLETA y el RI casi era simultáneamente mitad de lo que preveeríamos apenas basado en la serie, pero midiendo la masa molar con la concentración de RI y la concentración ULTRAVIOLETA confirme que está correcta. Ya, ésta es información útil sobre el complejo que ayudará en la determinación del Massachusetts de la muela.

Moviéndose conectado al intasome, las señales de la dispersión, ULTRAVIOLETA, y de RI luminosas fueron utilizadas de calcular la masa molar y las fracciones en masa de cada parte en cada punto en el cromatógrama.

Esto mostró que la fracción de la proteína es el cerca de 90%, significar el 90% de la masa es proteína y el cerca de 10% es DNA. De acuerdo con esta información, conseguimos el dn/dc para de extinción el coeficiente entero complejo y para eso complejo entero. Utilizamos esta concentración y este dn/dc entonces para calcular el Massachusetts de la muela. La masa molar total era 194 kilodaltons, así que sabemos que la pieza de la proteína es 174 kilodaltons, y la pieza de la DNA es cerca de 20 kilodaltons. Esto es equivalente a un tetrámero del integrase y de dos cabos de la DNA, que iguala la estructura cristalina.

Fue observado que la masa molar no era constante a través del pico, indicando que la disociación del tetrámero de la proteína pudo haber ocurrido durante una separación o una cierta especie no puede ser saturada. El estudio de caso siguiente muestra cómo podemos medir estas clases de afinidades y de estequiometría en la solución.

¿Tan cómo CG-MALS difiere de SEC-MALS?

CG-MALS es la técnica que nos permite dimensión la afinidad y la estequiometría de los complejos que forman en la solución.

A diferencia en del estudio de caso anterior, MALS se aplica a las muestras unfractionated. Una serie de muestras de diversas composiciones se inyecta en los detectores de la dispersión luminosa y de la concentración así que podemos utilizar MALS para determinar la masa molar en cada composición. El cambio en la masa molar se puede entonces relacionar con la formación de complejos en la solución.

De esta manera, podemos fijar la autoasociación y el equilibrio entre el monómero y dimero y dimero y trímero. Midiendo la masa molar en función de la concentración, podemos determinar la afinidad de la autoasociación y la estequiometría.

Si ningunos complejos forman, la masa molar tirante constante en función de la concentración. Pues los complejos tienen gusto de los dimeros y los trímeros forman, vemos un aumento en la masa molar en función de la concentración. Usando un modelo apropiado, podemos ajustar este aumento para informarnos la afinidad y la estequiometría de la asociación.

La misma técnica se puede aplicar a una acción recíproca entre dos diversas especies. La composición apenas incluye concentraciones diversas de ambas especies. Conseguimos mediciones cuando cada uno de la especie es superior así que podemos muestrear la estequiometría entera de esa acción recíproca.

Como los complejos forman, la masa molar de los aumentos de esa solución que dan una curva característica. Cuanto más complejos ata, más fuerte es la acción recíproca. Esto hace el más alto máximo y más afilado.

También, la posición del pico nos informa sobre la estequiometría de la solución. Si la especie B tiene un punto de enlace para la especie A, veremos el ápice máximo en la índice de la muela del 1:1. Si cada B puede atar dos moléculas de A, veremos el máximo en la índice molar del 2:1 y así sucesivamente.

También, desde la técnica de CG-MAL mide la masa molar directamente, podemos informar la diferencia, por ejemplo, entre un 1:1 y una acción recíproca del 2:2. Ambos alcanzarán un máximo en la misma posición, pero podemos todavía distinguir pues el complejo del 2:2 tendrá dos veces el Massachusetts de la muela.

¿Qué complejo fue estudiado usando CG-MALS en su segundo estudio de caso?

CG-MALS fue utilizado para investigar un recombinase de Cre en complejo con un sitio de reconocimiento de la DNA del loxP.

En primer lugar, utilizamos un gradiente de concentración del Cre para medir la masa molar de esa proteína solamente y para determinar si él los uno mismo-socios. Una prueba similar conducto para la DNA en sí mismo. Las mediciones de MALS fueron tomadas para cada molécula en cinco diversas concentraciones.

La masa molar de cada molécula no aumentó a través del alcance de concentración, mostrando que uno mismo-no se están asociando en absoluto. El Cre dio una masa molar constante de 39 kilodaltons, que es constante con un monómero, y la masa molar de la DNA midió un kilodalton del constante 23, que es también el monómero.

La asociación entre la enzima y la DNA entonces fue estudiada. Las mezclas de la proteína y de la DNA en 13 diversas concentraciones eran analizadas en el MALS fluyen célula. El aumento en la intensidad de la dispersión luminosa era proporcional al aumento en la masa molar en un cierto plazo, pues los complejos de Cre/loxP fueron formados.

La masa molar en el equilibrio fue encontrada para ser alrededor 110 kilodaltons. Esto inmediatamente nos informó que la estequiometría es mayor que 1:1 pues 39 más 23 es solamente 62.

El pico estaba en la posición correcta para un 2:1 que ataba índice, pero la masa molar era todavía mayor que debe estar para tal complejo, sugiriendo que algunas estructuras más de categoría alta se están formando bastante que un 1:1 o un complejo estándar del 2:1. Esto fue soportada por la curvatura en las altas índices de la DNA a una proteína que no está siendo capturada por un modelo simple del 2:1.

La medición de las masas molares mostró que había real tres diversos complejos. Primer es una proteína de Cre limitada a la DNA, y este primer atascamiento ocurre con un constante de la disociación del equilibrio de 170 nanomolar.

Un segundo Cre entonces ata a este complejo de una manera cooperativa. Una vez que una proteína de Cre está limitada a la DNA la afinidad para segunda aumenta. Finalmente, este hetero-tetrámero de Cre-loxP dimerizes con una afinidad de 400 nanomolar.

Las concentraciones de exploración de un único experimento de CG-MALS de apenas unas centenas nanomolar para cada especie nos permitieron así describir este mecanismo obligatorio del tres-paso completo.

No era necesario trabajar en regímenes múltiples de la concentración o asumir que uno o más de estos puntos de enlace están saturados completo, o que una porción de esta reacción es insignificante. Usted puede conseguir la caracterización y la dimensión completas todo ello con apenas un único experimento.

No sólo usted consigue la afinidad y la estequiometría, pero CG-MALS también le da la composición de la solución para cada mezcla.

 

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¿Puede usted darnos un resumen abreviado de los dos estudios de caso?

Sí, esperanzadamente, también he mostrado esa dispersión luminosa, o con el fraccionamiento o en proceso discontinuo, no está apenas para las proteínas. Estos mismos análisis son críticos para la DNA y el ARN, y para caracterizar los ácidos nucléicos en complejo con otras moléculas.

Los dos estudios de caso destacaron dos diversas clases de caracterizaciones que se pueden obtener para los sistemas similares de protein/DNA usando MALS.

SEC-MALS con análisis de la conjugación de la proteína nos dio la masa molar absoluta y la proteína y la fracción de la DNA para un integrase viral limitan a su ligand de la DNA. Esto fue hecha sin patrones en masa molares y sin si se asume que cualquier cosa sobre la estequiometría.

CG-MALS en proceso discontinuo sin cromatografía nos permite cuantificar la afinidad y la estequiometría de eso complejo en una acción recíproca de varias fases de protein/DNA. El análisis de interacción no requiere la etiqueta o la inmovilización.  

¿Dónde pueden nuestros programas de lectura ir a descubrir más?

Para descubrir más, visite por favor nuestro Web site - www.wyatt.com/SEC-MALS y www.wyatt.com/CG-MALS.

Sobre Sophia Kenrick

El Dr. Sophia Kenrick es científico mayor del uso en la tecnología de Wyatt donde ella soporta los usos múltiples para la instrumentación de Wyatt, especialmente en el campo del reconocimiento molecular y de las acciones recíprocas biomoleculares.

Sophia sirve como el director de servicios analíticos y como el decano de la universidad de la dispersión luminosa, campus de Santa Barbara.

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