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Caratterizzando ed isolando (le bio-) strutture macromolecolari facendo uso di MALLES VENOSTA

Thought LeadersAlbena Lederer Head of the Polymer Separation Group Leibniz Institute for Polymer Research

In questi intervista, Albena Lederer, testa del gruppo di separazione del polimero all'istituto di Leibniz per ricerca del polimero, i colloqui alle scienze biologiche Notizia-Mediche circa le tecniche ed i metodi impiegati per capire ed analizzare i polimeri.  

Albena riguarda la teoria e la pratica dei metodi sperimentali per l'analisi di conformazione, la loro applicazione nell'analisi delle architetture macromolecolari semplici e l'uso sia di conformazione che dell'analisi quantitativa per più sistemi complessi.

Perché è la separazione e la caratterizzazione delle architetture biomacromolecular e specificamente di macromolecole, così importanti?

La multidispersione nei sistemi macromolecolari è un punto chiave che deve essere considerato quando sintonizza i beni materiali. La multidispersione, in termini di peso macromolecolare, significa che abbiamo le dimensioni e lunghezze differenti delle catene del polimero. Quando stiamo parlando dei polimeri, un'altra questione che anche dobbiamo considerare è topologia: i polimeri si sono ramificati, che tipo stanno ramificando fanno essi esibiscono e come questa ramificazione influenza la funzionalità, il numero dei gruppi funzionali ed i beni di interazione? Queste emissioni sono accoppiate direttamente con la conformazione di questi polimeri, quindi abbiamo bisogno delle tecniche e dei metodi di capirli separando ed analizzando le molecole in termini di peso molecolare, dimensione e conformazione.

Che cosa è il metodo più comune impiegato per l'analisi di conformazione delle macromolecole?

Il metodo main per l'analisi di conformazione è scattering leggero statico di multi-angolo (MALS). MALLES VENOSTA ci dà il rapporto angolo-dipendente di Rayleigh, che può essere analizzato per determinare la massa molare ed il raggio della rotazione R.g Ora, avendo la massa e raggio della rotazione molari da questo metodo, possiamo misura i dati all'equazione per la operazione di disgaggio del flusso, dove il parametro di scala direttamente è accoppiato alla conformazione di una particella o di una macromolecola. L'ulteriore informazione che calcoliamo da questa è la densità apparente; un parametro importante, relativo a conformazione ed a compattezza delle macromolecole o delle particelle.

Possiamo combinare lo scattering leggero statico con lo scattering leggero dinamico, che ci dà direttamente parametro del cosiddetto Rho del `' per capire la forma delle nostre particelle e macromolecole. Il Rho è il rapporto della Rg (determinata a partire da MALLES VENOSTA) al raggio idrodinamico Rh (determinato a partire dallo scattering leggero dinamico, o da DLS).

Un altro modo usare lo scattering leggero statico è congiuntamente alla viscosità intrinseca.  La connessione fra la viscosità intrinseca e la massa molare è la cosiddetta equazione del Kuhn-Segno-Houwink. I parametri del Kuhn-Segno-Houwink rappresentano un altro modo descrivere la conformazione delle macromolecole o delle particelle.

I parametri ottenuti facendo uso di questi metodi sono molare-massa-dipendenti, in modo da significa che dobbiamo caratterizzare una serie di masse molari che comprendono un campione del polimero. Ciò non è solitamente molto facile da compire appena facendo uso delle differenze nella sintesi e nelle circostanze tecniche.

Come otteniamo una serie di massa molare?

Eseguiamo solitamente il frazionamento per separare una serie di masse molari. Il frazionamento preparatorio è un metodo ben noto per ottenere le frazioni secondo la massa molare; tuttavia, è molto sforzo.

Un metodo molto più veloce e più di alta risoluzione per ottenere le masse molari differenti è la cromatografia analitica di esclusione di dimensione (SEC). Ciò è da una separazione guidata da entropia che funziona separando una singola iniezione del campione nelle frazioni, ciascuna con una distribuzione molto stretta delle masse molari. Sec è adatta a tutta la dimensione delle macromolecole dalle masse molari molto basse fino ad un massimo di parecchi milioni.

Un altro metodo è frazionamento di campo-flusso (FFF). In questo metodo, le particelle sono separate secondo i loro beni della diffusione. Ciò significa che possiamo separare i più vasti intervalli di massa molari confrontati alla cromatografia di esclusione di dimensione, senza le forti forze di taglio presenti in cromatografia di esclusione di dimensione. FFF non è come utile nell'intervallo di massa molare sotto circa 5000 Daltons dove le macromolecole penetrano la membrana del canale e non si eluiscono verso i rivelatori. Tuttavia, lavorando con i più grandi complessi e particolarmente con i grandi sistemi del biomacromolecule che possono notevolmente superare il limite superiore di sec, FFF è realmente molto utile.

Coppia una di queste tecniche di separazione, sec o FFF, con MALLES VENOSTA, la rilevazione specifica della viscosità e DLS consegna i risultati molto interessanti ed apprezzati in termini di separazione macromolecolare e caratterizzazione-SEC-MALLES VENOSTA-DLS-IV o FFF-MALS-DLS-IV.

Come potete usare l'analisi di conformazione per determinare le architetture macromolecolari semplici?

Per ottenere le informazioni conformazionali complete su questi polimeri, dobbiamo usare accoppiati ad un rivelatore di DLS. Ulteriormente, abbiamo un rivelatore di concentrazione, che è necessario per completamente analizzare i dati leggeri statici di scattering e un rivelatore della viscosità. Così otteniamo quattro cromatogrammi diversi da questo sistema. Facendo uso di tutte questi informazioni possiamo definitivo calcolare i nostri tre raggi differenti: raggio della rotazione, raggio idrodinamico e raggio di viscosità.

Ora, avendo questi informazioni ed anche le informazioni sulle masse del molare, possiamo definitivo tracciare i risultati per valutare il flusso di operazione di disgaggio e l'equazione del Kuhn-Segno-Houwink.

Credito di immagine: Shutterstock/JuanGaertner

Che cosa fa un complesso biomolecolare del sistema?

Molti questi sistemi sono basati sui sistemi di portafili multivalent, che sono basati sulle macromolecole accoppiate con differenti tipi di peptidi, anticorpi, gli acidi nucleici, droghe, ecc.

Questo accoppiamento può essere covalente, ma principalmente non è e l'associazione non covalente è la sfida principale per la caratterizzazione facendo uso dei metodi di separazione e delle tecniche differenti di rilevazione. Stiamo lavorando con i sistemi del biopolimero o i sistemi biomacromolecular in cui una multidispersione molto pronunciata esiste. Ciò significa che abbiamo grandi macromolecole combinate con le piccole droghe, i bioconjugates differenti o i biohybrids nelle dimensioni differenti, o più di due componenti all'interno dell'un sistema.

Questi sistemi sono, nella maggior parte dei casi, rispondenti contro le circostanze esterne. Dobbiamo capire come la conformazione dipende dalle circostanze e dallo stato che raggiungono. Egualmente dobbiamo tipicamente quantificare la quantità di droga, per esempio e capire i trattamenti dell'auto-installazione dei sistemi.

Che cosa è il migliore metodo per l'esecuzione dell'analisi di conformazione su questi sistemi complessi?

Il frazionamento di flusso di campo asimmetrico di flusso (AF4) è un metodo ideale per aiutarci a capire i beni dei sistemi biomacromolecular. La separazione facendo uso di questo metodo funziona secondo i coefficienti di diffusione delle particelle o delle macromolecole graduate differenti e le forze di taglio basse permettono che un vasto intervallo di massa molare sia analizzato.

Possiamo cambiare molto facilmente l'eluente (pH) e, facendo uso di AF4 insieme con i rivelatori differenti, caratterizzare la massa e le distribuzioni per ampiezza molari come pure caratterizzare quantitativamente, per esempio, una quantità di droga incapsulata. Quando AF4 è accoppiato con rilevazione che di DLS e di MALLES VENOSTA possiamo ottenere i parametri di conformazione in termini di esponente di operazione di disgaggio come pure parametro di forma, Rho.

Credito di immagine: Shutterstock/JuanGaetner

Come effettuate l'analisi di quantificazione dei sistemi biomacromolecular complessi?

Eseguiamo l'analisi di quantificazione su questi sistemi da MALLES VENOSTA ci siamo accoppiati con RI e rilevazione UV.

Un buon esempio di questo è la quantificazione dei polymersomes: vescicole basate sulle componenti copolymeric con le parti idrofobe ed idrofile, simili ai liposomi, che possono auto-montare ed incapsulano altre molecole. Questi polimeri sono uniti con legami atomici incrociati in moda da, secondo il pH, poterli restringere o aprire essi la loro membrana, permettendo che le piccole molecole dell'ospite penetrino. Utilizzerò l'esempio di mioglobina incapsulato in un polymersome che, secondo il pH, può trasformare il guaiacolo nel biphenoquinone.

La domanda compare, quante molecole della mioglobina può essere incapsulata all'interno di una polymersome? Per rispondere a questo problema usiamo AF4 accoppiati a MALLES VENOSTA ed a rilevazione UV per individuare sia la mioglobina che il polymersome.

La mioglobina e polymersome hanno dimensioni molto differenti. Mentre la mioglobina è circa 17.000 Daltons, i polymersomes hanno dimensioni al di sopra di 100 nanometri. La rilevazione UV della mioglobina mostra un chiaro segnale mentre il polymersome produce lo stesso segnale di MALLES VENOSTA con o senza mioglobina. Di conseguenza, individuando la mioglobina residua che non è incapsulata nei polymersomes, possiamo retro-calcolare la quantità di polymersome incapsulato.

Che cosa altre applicazioni di SEC-MALS-DLS-IV e di FFF-MALS-DLS voi prevedono?

Usiamo estesamente queste tecniche per caratterizzare i polimeri dentritici e pseudo-dentritici, l'aggregazione e l'auto-installazione macromolecolare, la formazione di biohybrids che coppia le proteine ed i biopolimeri e l'nano-incapsulamento di piccole droghe della molecola (come pure di proteine). Oltre a questi, i metodi sono ampiamente applicabili a molti sistemi macromolecolari e supromacromolecular, particolarmente nel contesto dei materiali e del nanotherapeutics novelli.

Dove possono i nostri lettori andare scoprire più?

Per scoprire di più vogliate per visualizzare www.wyatt.com/Polymers e www.wyatt.com/Nanoparticles.

Circa Albena Lederer

Albena Lederer è uno scienziato nel dipartimento analitico dell'istituto di chimica macromolecolare a IPF Dresda e capo del gruppo della separazione del polimero.

È un professore straordinario alla chimica di dipartimento ed alla scienza del polimero dell'università di Stellenbosch.

Citations

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