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Caracterizando y aislando (las bio) estructuras macromoleculares usando MALS

Thought LeadersAlbena Lederer Head of the Polymer Separation Group Leibniz Institute for Polymer Research

En esta entrevista, Albena Lederer, la culata de cilindro del grupo de la separación del polímero en el instituto de Leibniz para la investigación del polímero, negociaciones a las ciencias de la vida Noticia-Médicas sobre las técnicas y métodos usados para entender y para analizar los polímeros.  

Albena reviste teoría y la práctica de los métodos experimentales para el análisis de conformación, su uso en el análisis de configuraciones macromoleculares simples y el uso de la conformación y del análisis cuantitativo para sistemas más complejos.

¿Por qué es la separación y la caracterización de configuraciones biomacromolecular, y específicamente de macromoléculas, tan importantes?

La polidispersidad en sistemas macromoleculares es una cuestión clave que tiene que ser tenida en cuenta al sintonizar propiedades materiales. La polidispersidad, en términos de peso macromolecular, significa que tenemos diversos tallas y largos de las cadenas del polímero. Cuando estamos hablando de los polímeros, el otro tema que también tenemos que tener en cuenta es topología: ¿se ramifican los polímeros, qué tipo de ramificarse hacen ellos exhiben, y cómo el este ramificarse influencian las funciones, el número de grupos funcionales y las propiedades de la acción recíproca? Estas entregas se acoplan directamente con la conformación de estos polímeros, por lo tanto necesitamos técnicas y métodos entenderlos separando y analizando las moléculas en términos de peso molecular, talla, y conformación.

¿Cuál es el método más común usado para el análisis de conformación de macromoléculas?

El método principal para el análisis de conformación es dispersión luminosa estática del multi-ángulo (MALS). MALS nos da la índice ángulo-relacionada de Rayleigh, que se puede analizar para determinar la masa molar y el radio del giro R.g Ahora, teniendo masa y radio del giro molares de este método, podemos ajustar los datos a la ecuación para escalar el flujo, donde el parámetro de la graduación a escala se acopla directamente a la conformación de una partícula o de una macromolécula. La información adicional que calculamos de esto es la densidad evidente; un parámetro importante, relacionado con la conformación y la compacticidad de macromoléculas o de partículas.

Podemos combinar la dispersión luminosa estática con la dispersión luminosa dinámica, que nos da directamente parámetro del supuesto rho del `' para entender la forma de nuestras partículas y macromoléculas. Rho es la índice de Rg (determinado de MALS) al radio hidrodinámico Rh (determinado de la dispersión luminosa dinámica, o de DLS).

Otra manera de utilizar la dispersión luminosa estática está conjuntamente con viscosidad intrínseca.  La conexión entre la viscosidad intrínseca y la masa molar es la supuesta ecuación de la Kuhn-Marca-Houwink. Los parámetros de la Kuhn-Marca-Houwink representan otra manera de describir la conformación de macromoléculas o de partículas.

Los parámetros obtenidos usando estos métodos son muela-masa-relacionados, así que significa que debemos caracterizar una serie de masas molares que comprenden una muestra del polímero. Esto no es generalmente muy fácil de lograr apenas usando diferencias en síntesis y condiciones técnicas.

¿Cómo obtenemos una serie en masa molar?

Realizamos generalmente el fraccionamiento para separar una serie de masas molares. El fraccionamiento preparatorio es un método bien conocido para obtener fracciones según la masa molar; sin embargo, es mucho esfuerzo.

Un método mucho más rápido y más de alta resolución para obtener diversas masas molares es cromatografía analítica de la exclusión de la talla (SEC). Ésta es una separación entropía-impulsada que trabaja separando una única inyección de la muestra en fracciones, cada uno con una distribución muy estrecha de masas molares. El SEC es conveniente para toda la talla de macromoléculas de masas molares muy inferiores hasta varios millones.

Otro método es fraccionamiento del campo-flujo (FFF). En este método, las partículas se separan según sus propiedades de la difusión. Esto significa que podemos separar alcances en masa molares más amplios comparados a la cromatografía de la exclusión de la talla, sin las fuerzas de resistencia fuertes presentes en cromatografía de la exclusión de la talla. FFF no está como beneficioso en el alcance en masa molar abajo de cerca de 5000 Daltons donde las macromoléculas penetran la membrana del canal y no se enjuagan hacia los detectores. Sin embargo, trabajando con complejos más grandes, y especialmente con los sistemas grandes del biomacromolecule que pueden exceder grandemente el límite superior del SEC, FFF es realmente muy útil.

Acoplando una de estas técnicas de separación, SEC o FFF, con MALS, la detección específica de la viscosidad y DLS entrega resultados muy interesantes y valiosos en términos de separación macromolecular y caracterización-SEC-MALS-DLS-IV o FFF-MALS-DLS-IV.

¿Cómo puede usted utilizar análisis de conformación para determinar configuraciones macromoleculares simples?

Para obtener la información conformacional completa sobre estos polímeros, necesitamos utilizar acoplados a un detector de DLS. Además, tenemos un detector de la concentración, que es necesario para analizar completo los datos estáticos de la dispersión luminosa, y un detector de la viscosidad. Obtenemos tan cuatro diversos cromatógramas de este sistema. Usando toda esta información podemos finalmente calcular nuestros tres diversos radios: radio del giro, radio hidrodinámico, y radio de la viscosidad.

Ahora, teniendo esta información, y también la información sobre las masas de la muela, podemos finalmente trazar los resultados para evaluar el flujo de la graduación a escala y la ecuación de la Kuhn-Marca-Houwink.

Haber de imagen: Shutterstock/JuanGaertner

¿Qué hace un complejo biomolecular del sistema?

Muchos estos sistemas se basan en los sistemas de onda portadora polivalentes, que se basan en las macromoléculas acopladas con diversos tipos de péptidos, los anticuerpos, ácidos nucléicos, drogas, y así sucesivamente.

Este acoplamiento puede ser covalente, pero sobre todo no es y el atascamiento no-covalente es el reto principal para la caracterización usando métodos de separación y diversas técnicas de la detección. Estamos trabajando con los sistemas del biopolímero o los sistemas biomacromolecular en los cuales una polidispersidad muy pronunciada existe. Esto significa que tenemos macromoléculas grandes combinadas con las pequeñas drogas, diversos bioconjugates o los biohybrids en diversas tallas, o más de dos componentes dentro del un sistema.

Estos sistemas son, en la mayoría de los casos, responsivos contra condiciones externas. Tenemos que entender cómo la conformación depende de las condiciones y del estado que logran. También necesitamos típicamente cuantificar la cantidad de droga, por ejemplo, y entender los procesos del uno mismo-montaje de los sistemas.

¿Cuál es el mejor método para realizar análisis de conformación en estos sistemas complejos?

El fraccionamiento de flujo de campo asimétrico de flujo (AF4) es un método ideal para ayudarnos a entender las propiedades de sistemas biomacromolecular. La separación usando este método trabaja según coeficientes de difusión de diversas partículas o macromoléculas clasificadas, y las fuerzas de resistencia inferiores permiten que un alcance en masa molar amplio sea analizado.

Podemos cambiar muy fácilmente el eluyente (pH) y, usando AF4 conjuntamente con diversos detectores, caracterizar la masa molar y las distribuciones dimensionales, así como caracterizar cuantitativo, por ejemplo, una cantidad de droga encapsulada. Cuando AF4 se acopla con la detección de MALS y de DLS que podemos obtener parámetros de la conformación en términos de exponente de la graduación a escala así como parámetro de la forma, rho.

Haber de imagen: Shutterstock/JuanGaetner

¿Cómo usted realiza el análisis de la cuantificación de sistemas biomacromolecular complejos?

Realizamos análisis de la cuantificación en estos sistemas por MALS acoplados con RI y la detección ULTRAVIOLETA.

Un buen ejemplo de esto es la cuantificación de polymersomes: vesículas basadas en componentes copolymeric con las piezas hidrofóbicas e hidrofílicas, similares a los liposomas, que pueden uno mismo-montar y encapsulan otras moléculas. Se reticulan estos polímeros de modo que, dependiendo del valor de pH, puedan encogerse o abrirse la membrana, permitiendo que las pequeñas moléculas de la huésped penetren. Utilizaré el ejemplo de la mioglobina encapsulado en un polymersome que, dependiendo del valor de pH, pueda transformar el guaiacol en biphenoquinone.

¿La pregunta aparece, cuántas moléculas de la mioglobina se puede encapsular dentro de una polymersome? Para contestar a esta pregunta utilizamos AF4 acoplados a MALS y a la detección ULTRAVIOLETA para descubrir la mioglobina y el polymersome.

La mioglobina y polymersome tienen tallas muy diversas. Mientras que la mioglobina es cerca de 17.000 Daltons, los polymersomes tienen tallas superior a 100 nanómetros. La detección ULTRAVIOLETA de la mioglobina muestra una señal sin obstrucción mientras que el polymersome produce la misma señal de MALS con o sin la mioglobina. Por lo tanto, descubriendo la mioglobina residual que no se encapsula en los polymersomes, podemos detrás-calcular la cantidad de polymersome encapsulada.

¿Qué otros usos de SEC-MALS-DLS-IV y de FFF-MALS-DLS usted preven?

Utilizamos estas técnicas extensivamente para caracterizar los polímeros dendríticos y pseudo-dendríticos, la agregación y el uno mismo-montaje macromolecular, la formación de biohybrids que acoplen las proteínas y los biopolímeros, y la nano-encapsulación de las pequeñas drogas de la molécula (así como de las proteínas). Además de éstos, los métodos son extensamente aplicables a muchos sistemas macromoleculares y supromacromolecular, especialmente en el contexto de los materiales y de nanotherapeutics nuevos.

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Sobre Albena Lederer

Albena Lederer es científico en el departamento analítico del instituto de la química macromolecular en IPF Dresden y culata de cilindro del grupo de la separación del polímero.

Ella es profesor extraordinario en la química del departamento y la ciencia del polímero de la universidad de Stellenbosch.

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