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Utilisant RMN pour étudier la structure des protéines, la dynamique et les mécanismes

Fábio AlmeidaNational NMR CenterFederal University of Rio de Janeiro

Une entrevue avec Fábio Almeida, décrivant le travail il fait à l'université du Rio de Janeiro au centre RMN national, concernant la structure et la dynamique des protéines.

Pouvez-vous veuillez se présenter et la recherche que vous effectuez à l'université fédérale du Rio de Janeiro ?

Mon nom est Fábio Almeida. Je travaille à l'université fédérale du Rio de Janeiro au centre RMN national, qui fait partie du centre de la biologie structurelle et du Bioimaging.

Cette installation multi-utilisatrice est ouverte d'un certain nombre d'usagers dans l'université et également à ceux d'autres universités et institutions de recherche au Brésil et à l'étranger. Nos spectromètres RMN sont renfermés dans l'élément structurel de biologie, mais nous avons également d'autres éléments procurables pour bioimaging de petits animaux et de microscopie.

Ma recherche est concentrée sur trois sujets. Tous concernent la structure et la dynamique des protéines, de l'orientation principale sur le rôle des mécanismes de dynamique et de protéine.

NMR in Cancer Studies

RMN dans des études de cancer d'AZoNetwork sur Vimeo.

J'étudie le thioredoxin, qui est une protéine très bien-sue. La structure a été résolue il y a plus de pendant trois décennies, mais il y a des éléments encore dynamiques et structurels qui doivent être décrits. Récent, nous avons décrit un de ces éléments dynamiques ; c'est la cavité de l'eau qui est essentielle et principale au mécanisme biologique de la protéine.

Nous avons également étudié le thioredoxin dans des eucaryotes plus élevés, qui ont eu un gain de − de fonctionnement la capacité d'effectuer des modifications goujon-de translation, telles que des vibrations et des dilatations passagères. Le mécanisme qui négocie la vibration passagère très bien-n'est pas su, ainsi nous emploient RMN pour étudier ce mécanisme.

L'autre partie de notre travail concerne des protéines de capsid de flavivirus. Nous décrivons le mécanisme de liaison des protéines de capsid de virus de dengue aux gouttelettes intracellulaires de lipide, qui est lié au métabolisme des lipides. Ce grippement est essentiel, ainsi nous avions l'habitude RMN de tracer l'interaction de cette protéine de capsid de virus de dengue avec ces gouttelettes de lipide. Puisque le grippement est essentiel, nous savons que ceci pourrait jeter la lumière sur la façon dont développer les composés neufs qui peuvent l'éviter.

Plus récent, nous avions étudié les protéines de capsid de virus de Zika, pour lesquelles nous avons juste résolu la structure. Nous faisons les études assimilées sur l'interaction des protéines de capsid de virus de Zika avec les molécules intracellulaires, pour négocier son mécanisme biologique.

Toutes ces interactions concernent la dynamique de ces protéines de capsid de flavivirus, si RMN est seul à et très important pour tels étudie.

Comment RMN utilisé est-il à la structure des protéines d'étude ?

RMN est une des trois méthodes employées pour étudier la structure des protéines, les autres qui sont cristallographie de rayon X et cryomicroscopy. RMN est la seule méthode qui permet aux études d'être entreprises en solution, qui est très important. RMN peut également être employé pour réaliser des études semi-conductrices.

RMN est spécial et seul parce que vous pouvez étudier non seulement la structure mais également la dynamique d'une protéine. Utilisant RMN, nous pouvons mesurer la propriété dynamique de chaque noyau dans la protéine, qui est très importante, parce que le dynamique est intimement lié au mécanisme biologique de la protéine.

Récent, là a été une révolution dans la biologie structurelle concernant la microscopie de cryo-électron. Cette méthode permet aux structures des composés moléculaires plus élevés d'être résolues, qui est très importante.

Jeux RMN très un rôle majeur dans cet endroit neuf de biologie structurelle parce que c'est la seule méthode qui active les études de la dynamique. Par exemple, les domaines multiples vus en quelques protéines est un gain de fonctionnement dans l'évolution, ainsi ils sont très importants et RMN peut nous aider à comprendre le mouvement de ces domaines.

Trente pour cent du génome ont ce que nous appelons les régions intrinsèquement désordonnées, qui sont des segments de la protéine qui n'ont pas une seule structure. D'une manière primordiale, une région intrinsèquement désordonnée est réellement un point de souplesse.

Dans ce sens, RMN est de nouveau tout seul que c'est la seule méthode qui nous permet de comprendre ces lieurs dans des protéines de multidomain. Ces lieurs sont également présents en plus petites protéines. Nous pouvons également les appeler « des lieurs entropiques, » parce qu'ils contribuent à l'entropie du système et sont principaux au mécanisme biologique.

Fabio RMN

Pourquoi est-ce que c'important dans le cadre des virus humains et les protéines est impliqué en entraînant la maladie ?

Toute les pathogénie est effectuée par le − de protéines et d'acides nucléiques peut-être leur association entre eux et, parfois, la reconnaissance des hydrates de carbone et des polysaccharides. RMN est seul parce que nous pouvons employer des propriétés lui pour regarder et de mesure directement au niveau atomique.

Pour toutes ces macromolécules biologiques (protéines, hydrates de carbone, et acides nucléiques), RMN est une des méthodes principales pour sonder et poser des questions biologiques.

Avec RMN, nous pouvons mesurer pas simplement la structure des protéines, mais la dynamique de chaque segment en ces molécules et la dynamique de l'interaction. Tous les mécanismes biologiques concernent des interactions entre ces molécules dans la cellule : interactions de protein−protein, interactions de RNA−DNA, et également interactions de protein−carbohydrate en petites molécules.

Ces interactions représentent tous les mécanismes pathologiques et les mécanismes biologiques impliqués et RMN est très bon pour mesurer eux et les jeux de dynamique de rôle. Dans ce sens, RMN est très un puissant outil.

Comment est-ce que des échantillons sont préparés pour l'analyse RMN ?

Pour préparer des protéines, vous devez sélecter le gène du − d'intérêt le gène qui est impliqué dans le pathologique ou mécanisme biologique que vous êtes désireux pour étudier. Vous devez copier ce gène dans les bactéries ou un système eucaryotique. Des bactéries est généralement employées, mais il y a plusieurs options pour les gènes de clonage dans ces systèmes hétérologues.

Puis, vous exprimez cette protéine, qui te permet de le marquer avec un isotope. Vous pouvez atteindre la protéine avec de l'azote 15, le carbone 13, le deutérium, et peut-être d'autres noyaux qui sont impliqués dans ce mécanisme biologique. Cependant, ce sont les trois noyaux par magnétisme actifs qui sont importants pour faire des mesures RMN.

Après marquage et épuration de la protéine, vous alors devez installer les conditions de travail pour faire les études RMN. Vous devez régler la température, le pH et imiter les conditions physiologiques aussi près que possible. Puis, vous pouvez vérifier l'effet des osmolytes et l'effet de la haute pression, par exemple. Vous pouvez mettre l'échantillon dans différentes conditions et vérifier ce qui arrive alors à la structure et à la dynamique de la protéine.

En résumé, la préparation des échantillons concerne copier le gène, exprimer la protéine, marquer la protéine d'un isotope, l'épurer et puis exécuter des analyses biologiques pour voir ce que sont les conditions idéales pour fonctionner avec la protéine.

Comment la spectroscopie RMN peut-elle être employée pour étudier la biologie de cancer et peut-elle guider le développement des demandes de règlement neuves ?

Il y a − de plusieurs de cancer protéines d'objectifs −mainly qui sont exprimés par les soi-disant oncogenes, les gènes qui expriment les protéines impliquées en formation des tumeurs. Habituellement, ces protéines sont impliquées en réglant le cycle cellulaire. La protéine peut être un suppresseur de tumeur tel que p53, qui est impliqué dans 50% de tous les cancers. Les mutations en cette protéine sont responsables de dysregulating le cycle cellulaire, qui est la cause principale du cancer.

Dire cela, RMN a également été principal à comprendre le rôle biologique, ainsi que la structure et la dynamique de p53, ainsi un certain nombre d'articles sur cette protéine ont été publiés.

RMN est seul dans ce sens, parce que vous pouvez également sonder d'autres effets, tels que la totalisation. Il y a un groupe à notre université qui étudie la totalisation p53 et à la façon dont elle active le développement et la transformation de la cellule cette des résultats sous la formation de cancer.

RMN est seul parce que vous pouvez sonder les effets en solution, s'il détermine la structure, mesurant la dynamique, ou mettant des protéines sous la tension aux conditions d'essai, par exemple. Nous avons également des groupes dans cette installation qui étudient d'autres objectifs liés au cancer tels que Grb2, un autre modulateur du cycle cellulaire. Il y a réellement beaucoup plus d'exemples que je pourrais indiquer ici.

Image montrant des protéines sur la surface de cellules, qui peut surfin | Shutterstock

Que recherchez-vous en choisissant l'instrumentation neuve pour votre laboratoire ?

D'abord, vous devriez penser très soigneusement au sujet de ce qu'est l'objectif scientifique et être très exact au sujet pour de ce que le spectromètre va être utilisé. Si le spectromètre va être utilisé pour des usages universels, il y a une occasion très élevée que des erreurs seront effectuées. Vous n'avez pas besoin d'être trop spécifique, mais il est bon de décider si la machine va être utilisée pour analyser la structure et la dynamique ou les petites molécules, par exemple.

Une fois que vous êtes clair au sujet de l'objectif scientifique et pour ce que l'instrument va être utilisé, puis vous pouvez également être clair en décidant du champ magnétique, qui détermine en grande partie combien le coût coûtera. Parfois, il est bien mieux utiliser trois spectromètres avec des inducteurs inférieurs qui coûteraient le même montant comme utilisant un instrument plus élevé d'inducteur, ainsi c'est très un aspect important à considérer.

Ensuite, vous devez choisir l'électronique. Vous devez indiquer exactement chaque détail de l'électronique afin d'effectuer l'idéal de spectromètre pour pour ce que vous l'employez. Vous devez décider de combien de glissières vous avez besoin, basé sur combien de noyaux vous allez mesurer. Ici, par exemple, tous nos spectromètres ont quatre glissières, parce que nous mesurons les protons, l'azote 15, le carbone 13, et le deutérium… bien que pas tout le monde ait besoin de quatre glissières. Vous devez également décider du pouls et pour cette raison du pouvoir que vous emploierez pour chaque glissière. Vous pouvez avoir besoin d'impulsions très courtes, vous signifiant le besoin le pouvoir d'être élevé, par exemple.

Une fois que vous avez choisi et avez monté l'électronique, vous devez vérifier si elle se comporte la voie que vous avez besoin de elle à. Vous devez l'établir selon les caractéristiques de la compagnie concernant la stabilité de champ magnétique, stabilité d'inducteur de pouls et ainsi de suite.

La maintenance est également très importante, particulièrement pour nous, étant au Brésil et très loin de l'Europe et des Etats-Unis où les plus grands centres sont. Vous devez vérifier si la compagnie a un équipage de maintenance dans votre pays, cela pourriez résoudre tous les problèmes avec l'électronique, vous aidez par exemple, et également parfois avec l'expérience. Ce partenariat avec la compagnie est très important.

Un autre aspect important est de faire participer quelqu'un qui est un expert en la matière de RMN, l'un ou l'autre un gestionnaire RMN qui a un Ph.D. dans RMN ou quelqu'un qui sont spécialisés en utilisant le spectromètre RMN. C'est aussi important que la qualité du matériel.

Qu'effectue un spectromètre RMN à partir de Bruker rester à l'extérieur des autres spectromètres RMN sur le marché ?

À notre centre RMN, nous avons six spectromètres RMN de Bruker de plusieurs forces de champ magnétique. Bruker fournit le matériel de bonne qualité qui s'améliore toujours comme le temps passe. Les aimants sont hautement homogènes et la niche et eux emploient seulement des quantités inférieures d'hélium, qui est cher.

L'électronique sont également de haute qualité et nous pouvons habituellement atteindre les techniciens de Bruker, qui vous parlent par les petits groupes concernant l'électronique que vous avez besoin.

En outre, quand nous sommes au Brésil, nous avons besoin réellement de ce partenariat avec la compagnie, qui dans notre cas, assure les travaux de matériel vingt-quatre heures sur vingt-quatre. Si vous investissez dans un spectromètre, vous devez s'assurer qu'il va fonctionner 24/7 et ce n'est pas simplement les gestionnaires au centre RMN qui sont responsables de celui, mais également l'équipage de maintenance chez Bruker.

Ce partenariat et le service client/support technique fourni est très important et les besoins pour être considéré avant que vous choisissiez dont la compagnie vous vont acheter votre spectromètre.

Au sujet de Fábio Almeida

Fabio BIO

Fabio C.L. Almeida est un expert en matière de structure des protéines et de dynamique par résonance magnétique nucléaire (NMR). Il a découvert la structure de plusieurs protéines par RMN. Il a également effectué de nombreuses découvertes importantes entourant la structure et la dynamique des defensins de centrale.

Fabio et son groupe ont montré cela en dépit du pliage économisé, étalage de defensins une grande variation en dynamique, qui a activé le mappage des régions obligatoires et la description du mécanisme de la reconnaissance de membrane.

Le groupe a également prouvé que la dynamique sont également la clavette pour la compréhension du mécanisme de la reconnaissance de membrane des peptides antimicrobiens. La commande préexistentielle en peptides flexibles permet la discrimination entre les régions du grippement spécifique et non spécifique.

Le groupe de Fabio a également décrit la structure et la dynamique de la cavité de l'eau du thioredoxin, qui est un élément structurel essentiel pour la catalyse. Fabio est le directeur du centre national de RMN (CNRMN) et du président de l'association RMN brésilienne (AUREMN).

Citations

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    Bruker BioSpin - NMR, EPR and Imaging. (2019, July 04). Utilisant RMN pour étudier la structure des protéines, la dynamique et les mécanismes. News-Medical. Retrieved on October 24, 2021 from https://www.news-medical.net/news/20190704/Using-NMR-to-Study-Protein-Structure-Dynamics-and-Mechanisms.aspx.

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