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Facendo uso di RMN per studiare la struttura, la dinamica ed i meccanismi della proteina

Fábio AlmeidaNational NMR CenterFederal University of Rio de Janeiro

Un'intervista con Fábio Almeida, descrivendo il lavoro fa all'università di Rio de Janeiro nel centro RMN nazionale, comprendendo la struttura e la dinamica delle proteine.

Possono voi presentarti prego e la ricerca che effettuate all'università federale di Rio de Janeiro?

Il mio nome è Fábio Almeida. Lavoro all'università federale di Rio de Janeiro nel centro RMN nazionale, che fa parte del centro di biologia strutturale e di Bioimaging.

Questa funzione multiutente è aperta ad una serie di utenti all'interno dell'università ed anche a quelle da altri università e centri di ricerca nel Brasile ed all'estero. I nostri spettrometri RMN sono alloggiati nell'unità strutturale di biologia, ma egualmente abbiamo altre unità disponibili per bioimaging di piccoli animali e della microscopia.

La mia ricerca è messa a fuoco su tre argomenti. Tutti comprendono la struttura e la dinamica delle proteine, con il fuoco principale sul ruolo della dinamica e dei meccanismi della proteina.

NMR in Cancer Studies

RMN negli studi del Cancro da AZoNetwork su Vimeo.

Studio il thioredoxin, che è una proteina molto bene-nota. La struttura è stata risolta più di tre decadi fa, ma ci sono elementi ancora dinamici e strutturali che devono essere descritti. Recentemente, abbiamo descritto uno di questi elementi dinamici; quella è l'intercapedine dell'acqua che è essenziale e chiave al meccanismo biologico della proteina.

Egualmente abbiamo studiato il thioredoxin in più alti eucarioti, che hanno avuti un guadagno del − di funzione la capacità di effettuare le modifiche post-di traduzione, quali le oscillazioni e le dilatazioni transitorie. Il meccanismo che media l'oscillazione transitoria molto bene-non è saputo, in modo da noi usa RMN per studiare questo meccanismo.

L'altra parte del nostro lavoro comprende le proteine del capsid di flavivirus. Descriviamo il meccanismo di legatura delle proteine del capsid del virus di febbre rompiossa alle goccioline intracellulari del lipido, che è collegato con il metabolismo dei lipidi. Questa associazione è essenziale, in modo da abbiamo usato RMN per mappare l'interazione di questa proteina del capsid del virus di febbre rompiossa con queste goccioline del lipido. Poiché l'associazione è essenziale, sappiamo che questa potrebbe fare luce su come sviluppare i nuovi composti che possono impedirlo.

Più recentemente, stiamo studiando le proteine del capsid del virus di Zika, per cui abbiamo risolto appena la struttura. Stiamo facendo i simili studi sull'interazione delle proteine del capsid del virus di Zika con le molecole intracellulari, per mediare il suo meccanismo biologico.

Tutte queste interazioni comprendono la dinamica di queste proteine del capsid di flavivirus, così RMN è unico a e molto importante per tali studia.

Come è RMN usato alla struttura della proteina di studio?

RMN è uno dei tre metodi impiegati per studiare la struttura della proteina, gli altri che sono cristallografia a raggi x e cryomicroscopy. RMN è il solo metodo che permette agli studi di essere intrapreso in soluzione, che è molto importante. RMN può anche essere usato per svolgere gli studi semi conduttori.

RMN è speciale ed unico perché potete studiare non solo la struttura ma anche la dinamica di una proteina. Facendo uso di RMN, possiamo misurare i beni dinamici di ogni nucleo nella proteina, che è molto importante, perché il dinamico è collegato intimamente con il meccanismo biologico della proteina.

Recentemente, ha stato un giro di motore nella biologia strutturale che comprende la microscopia dell'cryo-elettrone. Questo metodo permette alle strutture di più alti complessi molecolari di essere risolte, che è molto importante.

Giochi RMN un ruolo molto importante in questa nuova area di biologia strutturale perché è il solo metodo che permette agli studi sulla dinamica. Per esempio, i domini multipli veduti in alcune proteine è un guadagno della funzione nell'evoluzione, in modo da sono molto importanti e RMN può aiutarci a capire il moto di questi domini.

Trenta per cento del genoma hanno che cosa chiamiamo regioni intrinsecamente disordinate, che sono segmenti della proteina che non hanno una struttura unica. D'importanza, una regione intrinsecamente disordinata è realmente un punto della flessibilità.

In questo senso, RMN è ancora per quanto sia unico il solo metodo che ci permette di capire questi linker all'interno delle proteine del multidomain. Questi linker sono egualmente presenti in più piccole proteine. Possiamo anche chiamarli “linker entropici,„ perché contribuiscono all'entropia del sistema e sono chiave al meccanismo biologico.

Fabio RMN

Perché questo importante nel contesto degli agenti patogeni umani e delle proteine è compreso nel causare la malattia?

Tutta patogenesi è effettuata dal − degli acidi nucleici e delle proteine forse la loro associazione tra loro e, a volte, il riconoscimento dei carboidrati e polisaccaridi. RMN è unico perché possiamo usare i beni della misura e per esaminare direttamente al livello atomico.

Per tutte queste macromolecole biologiche (proteine, carboidrati ed acidi nucleici), RMN è uno dei metodi main per il sondaggio e fare delle domande biologiche.

Con RMN, possiamo misurare non appena la struttura della proteina, ma la dinamica di ogni segmento in queste molecole e la dinamica dell'interazione. Tutti i meccanismi biologici comprendono le interazioni fra queste molecole nella cella: interazioni del protein−protein, interazioni di RNA−DNA ed anche interazioni del protein−carbohydrate in piccole molecole.

Queste interazioni rappresentano tutti i meccanismi patologici ed i meccanismi biologici in questione e RMN è molto buoni per la misurazione loro e dei giochi di dinamica di ruolo. In questo senso, RMN è uno strumento molto potente.

Come i campioni sono preparati per l'analisi RMN?

Per preparare le proteine, dovete selezionare il gene del − di interesse il gene che è compreso nel meccanismo che patologico o biologico siete entusiasta studiare. Dovete clonare quel gene in batteri o in un sistema eucariotico. I batteri è usato più comunemente, ma ci sono parecchie opzioni per i geni di clonazione in questi sistemi eterologi.

Poi, esprimete questa proteina, che gli permette di contrassegnarla con un isotopo. Potete raggiungere la proteina con azoto 15, carbonio 13, il deuterio e forse altri nuclei che sono compresi in questo meccanismo biologico. Tuttavia, questi sono i tre nuclei magneticamente attivi che sono importanti per fare le misure RMN.

Dopo il contrassegno e la depurazione della proteina, poi dovete installare i termini del lavoro per fare gli studi RMN. Dovete fissare la temperatura, il pH ed imitare le circostanze fisiologiche quanto più rigorosamente possibile. Poi, potete verificare l'effetto dei osmolytes e l'effetto di alta pressione, per esempio. Potete mettere il campione nelle circostanze differenti e provare che cosa poi accade alla struttura ed alla dinamica della proteina.

Riassumendo, il preparato del campione comprende clonare il gene, esprimere la proteina, contrassegnare la proteina con un isotopo, depurarlo e poi eseguire le analisi biologiche per vedere che cosa le circostanze ideali sono per il lavoro con la proteina.

Come può la spettroscopia RMN essere usata per studiare la biologia del cancro e può guidare lo sviluppo di nuovi trattamenti?

C'è − che sono espressi dai cosiddetti oncogeni, i geni di parecchie del cancro proteine degli obiettivi −mainly che esprimono le proteine in questione nella formazione di tumori. Solitamente, queste proteine sono comprese nel gestire il ciclo cellulare. La proteina può essere un soppressore del tumore quale p53, che è compreso in 50% di tutti i cancri. Le mutazioni in questa proteina sono responsabili del dysregulating il ciclo cellulare, che è la causa principale di cancro.

Dire quello, RMN egualmente è stato chiave a capire il ruolo biologico come pure la struttura e la dinamica di p53, in modo da una serie di articoli su questa proteina sono stati pubblicati.

RMN è unico in questo senso, perché potete anche sondare altri effetti, quale l'aggregazione. C'è un gruppo nella nostra università che studia l'aggregazione p53 ed in come permette allo sviluppo ed alla trasformazione della cella quella risultati nella formazione del cancro.

RMN è unico perché potete sondare gli effetti in soluzione, se sta determinando la struttura, misurando la dinamica, o mettendo le proteine nell'ambito dello sforzo alle condizioni di prova, per esempio. Egualmente abbiamo gruppi in questa funzione che studiano altri obiettivi in relazione con il Cancro quale Grb2, un altro modulatore del ciclo cellulare. Ci sono realmente molti altri esempi che potrei quotare qui.

Immagine che mostra le proteine sulla superficie delle cellule, che può essere analizzata facendo uso della spettroscopia RMN.urfin | Shutterstock

Che cosa cercate quando sceglie la nuova strumentazione per il vostro laboratorio?

In primo luogo, dovreste pensare molto con attenzione circa cui lo scopo scientifico è ed essere molto esatto circa cui lo spettrometro sta andando essere utilizzato per. Se lo spettrometro sta andando essere utilizzato per gli usi generali, c'è una probabilità molto alta che gli errori saranno fatti. Non dovete essere troppo specifico, ma è buono da decidere se il commputer sta andando essere utilizzato per analizzare la struttura e dinamica o piccole molecole, per esempio.

Una volta che siete chiaro circa lo scopo scientifico e cui lo strumento sta andando essere utilizzato per, quindi potete anche essere chiaro quando decide del campo magnetico, che in gran parte determina quanto il costo sarà. A volte, è molto meglio utilizzare tre spettrometri con i campi più bassi che costerebbero lo stesso importo di facendo uso di più alto strumento del campo, in modo da questo è molto un aspetto importante da considerare.

Dopo, dovete scegliere l'elettronica. Dovete segnare ogni dettaglio con esattezza dell'elettronica per fare l'ideale dello spettrometro per cui state usandolo per. Dovete decidere quanti canali avete bisogno, in base a quanti nuclei state andando misurare. Qui, per esempio, tutti i nostri spettrometri hanno quattro canali, perché misuriamo i protoni, l'azoto 15, il carbonio 13 ed il deuterio… sebbene non tutti abbiano bisogno di quattro canali. Egualmente dovete decidere dell'impulso e quindi della potenza che userete per ogni canale. Potete avere bisogno molto degli impulsi di scarsità, significante vi bisogno la potenza essere alto, per esempio.

Una volta che avete scelto ed installato l'elettronica, dovete provare se sta comportandosi il modo che lo avete bisogno a. Dovete installarlo conformemente alle specifiche della società per quanto riguarda la stabilità del campo magnetico, la stabilità del campo di impulso ecc.

La manutenzione è egualmente molto importante, particolarmente per noi, provenendo nel Brasile e finora da Europa e dagli Stati Uniti in cui i più grandi centri sono. Dovete controllare se la società ha una squadra di manutenzione nel vostro paese, quello potreste risolvere tutti i problemi con l'elettronica, per esempio ed egualmente a volte vi aiutate con l'esperimento. Questa associazione con la società è molto importante.

Un altro aspetto importante è di fare partecipare qualcuno che sia un esperto in materia di RMN, l'uno o l'altro un gestore RMN che ha un Ph.D. in RMN o qualcuno che siano specializzati nel per mezzo dello spettrometro RMN. Ciò è importante quanto la qualità della strumentazione.

Che cosa fa uno spettrometro RMN da Bruker stare fuori dagli altri spettrometri RMN sul servizio?

Nel nostro centro RMN, abbiamo sei spettrometri RMN di Bruker di parecchie resistenze di campo magnetico. Bruker fornisce la strumentazione di buona qualità che sta migliorando sempre col passare del tempo. I magneti sono altamente omogenei e la stalla ed essi usano soltanto gli importi bassi di elio, che è costoso.

L'elettronica è egualmente di alta qualità e possiamo solitamente accedere agli ingegneri di Bruker, che vi parlano attraverso i dettagli per quanto riguarda l'elettronica che avete bisogno di.

Inoltre, quando siamo nel Brasile, realmente abbiamo bisogno di questa associazione con la società, che nel nostro caso, assicura gli impianti della strumentazione ventiquattr'ore su ventiquattro. Se investite in uno spettrometro, dovete assicurarti che stia andando lavorare 24/7 e non è appena i gestori nel centro RMN che siano responsabili di quello, ma anche la squadra di manutenzione a Bruker.

Questa associazione ed il servizio di assistenza al cliente/supporto tecnico fornito è molto importanti e necessità da essere considerato prima che scegliate da cui la società voi sta andando approvvigionare il vostro spettrometro.

Circa Fábio Almeida

Fabio BIO-

Fabio C.L. Almeida è un esperto nella struttura e nella dinamica della proteina da a risonanza magnetica nucleare (NMR). Ha scoperto la struttura di parecchie proteine da RMN. Egualmente ha fatto le numerose scoperte importanti che circondano la struttura e la dinamica dei defensins dell'impianto.

Fabio ed il suo gruppo hanno mostrato quello malgrado la piegatura conservata, visualizzazione dei defensins un'ampia variazione nella dinamica, che ha permesso alla mappatura delle regioni obbligatorie ed alla descrizione del meccanismo del riconoscimento della membrana.

Il gruppo egualmente ha indicato che la dinamica è egualmente il tasto per la comprensione del meccanismo del riconoscimento della membrana dei peptidi antimicrobici. L'ordine preesistenziale in peptidi flessibili permette la distinzione fra le regioni di associazione specifica e non specifica.

Il gruppo di Fabio egualmente ha descritto la struttura e la dinamica dell'intercapedine dell'acqua di thioredoxin, che è un elemento strutturale essenziale per la catalisi. Fabio è il Direttore del centro nazionale di RMN (CNRMN) e di Presidente dell'associazione RMN brasiliana (AUREMN).

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    Bruker BioSpin - NMR, EPR and Imaging. (2019, July 04). Facendo uso di RMN per studiare la struttura, la dinamica ed i meccanismi della proteina. News-Medical. Retrieved on October 27, 2021 from https://www.news-medical.net/news/20190704/Using-NMR-to-Study-Protein-Structure-Dynamics-and-Mechanisms.aspx.

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