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Utilização NMR para estudar a estrutura, a dinâmica e os mecanismos da proteína

Fábio AlmeidaNational NMR CenterFederal University of Rio de Janeiro

Uma entrevista com Fábio Almeida, descrevendo o trabalho faz na universidade de Rio de Janeiro no centro NMR nacional, envolvendo a estrutura e a dinâmica das proteínas.

Por favor podem você introduzir-se e a pesquisa que você realiza na universidade federal de Rio de Janeiro?

Meu nome é Fábio Almeida. Eu trabalho na universidade federal de Rio de Janeiro no centro NMR nacional, que é parte do centro da biologia estrutural e do Bioimaging.

Esta facilidade do multi-usuário está aberta a um número de usuários dentro da universidade e igualmente àquelas de outras universidades e instituições de pesquisa em Brasil e no exterior. Nossos espectrómetros NMR são abrigados na unidade estrutural da biologia, mas nós igualmente temos outras unidades disponíveis para bioimaging de animais pequenos e de microscopia.

Minha pesquisa é centrada sobre três assuntos. Todo envolvem a estrutura e a dinâmica das proteínas, com o foco principal no papel da dinâmica e dos mecanismos da proteína.

NMR in Cancer Studies

NMR em estudos do cancro de AZoNetwork em Vimeo.

Eu estudo o thioredoxin, que é uma proteína muito conhecida. A estrutura foi resolvida mais de três décadas há, mas há os elementos ainda dinâmicos e estruturais que precisam de ser descritos. Recentemente, nós descrevemos um destes elementos dinâmicos; aquela é a cavidade da água que é essencial e chave ao mecanismo biológico da proteína.

Nós igualmente estudamos o thioredoxin em uns eukaryotes mais altos, que tivessem um ganho do − da função a capacidade para realizar alterações cargo-translational, tais como oscilações e dilatações transientes. O mecanismo que negocia a oscilação transiente não é muito conhecido, assim que nós usa-se NMR para estudar este mecanismo.

A outra parte de nosso trabalho envolve proteínas do capsid do flavivirus. Nós descrevemos o mecanismo obrigatório de proteínas do capsid do vírus de dengue às gotas intracelulares do lipido, que é relacionado ao metabolismo de lipido. Este emperramento é essencial, assim que nós usamo-nos NMR para traçar a interacção desta proteína do capsid do vírus de dengue com estas gotas do lipido. Desde que o emperramento é essencial, nós sabemos que este poderia derramar a luz em como desenvolver os compostos novos que podem a impedir.

Mais recentemente, nós temos estudado as proteínas do capsid do vírus de Zika, para que nós apenas resolvemos a estrutura. Nós estamos fazendo estudos similares na interacção de proteínas do capsid do vírus de Zika com moléculas intracelulares, para negociar seu mecanismo biológico.

Todas estas interacções envolvem a dinâmica destas proteínas do capsid do flavivirus, tão NMR é original a e muito importante para tais estuda.

Como é NMR usado à estrutura da proteína do estudo?

NMR é um dos três métodos usados para estudar a estrutura da proteína, o outro que é cristalografia do raio X e cryomicroscopy. NMR é o único método que permite os estudos de ser conduzido na solução, que é muito importante. NMR pode igualmente ser usado para executar estudos de circuito integrado.

NMR é especial e original porque você pode estudar não somente a estrutura mas igualmente a dinâmica de uma proteína. Usar-se NMR, nós podemos medir a propriedade dinâmica de cada núcleo na proteína, que é muito importante, porque o dinâmico é relacionado intimately ao mecanismo biológico da proteína.

Recentemente, tem estado uma revolução na biologia estrutural que envolve a microscopia do cryo-elétron. Este método permite as estruturas de uns complexos moleculars mais altos de ser resolvido, que é muito importante.

Jogos NMR um papel muito importante nesta área nova da biologia estrutural porque é o único método que permite os estudos da dinâmica. Por exemplo, os domínios múltiplos considerados em algumas proteínas são um ganho da função na evolução, assim que são muito importantes e NMR pode ajudar-nos a compreender o movimento destes domínios.

Trinta por cento do genoma têm o que nós chamamos as regiões intrìnseca desorganizado, que são os segmentos da proteína que não têm uma estrutura original. Importante, uma região intrìnseca desorganizado é realmente um ponto da flexibilidade.

Neste sentido, NMR é outra vez por mais original que seja o único método que nos permite de compreender estes linkers dentro das proteínas do multidomain. Estes linkers estão igualmente actuais em proteínas menores. Nós podemos igualmente chamá-los “linkers entrópicos,” porque contribuem à entropia do sistema e são chaves ao mecanismo biológico.

Fabio NMR

Por que isto importante no contexto dos micróbios patogénicos humanos e das proteínas é envolvido em causar a doença?

Toda a patogénese é realizada pelo − das proteínas e dos ácidos nucleicos talvez sua associação um com o outro e, às vezes, o reconhecimento dos hidratos de carbono e polisacáridos. NMR é original porque nós podemos usar propriedades ele para olhar e da medida directamente a nível atômico.

Para todas estas macromoléculas biológicas (proteínas, hidratos de carbono, e ácidos nucleicos), NMR é um dos métodos principais para sondar e fazer perguntas biológicas.

Com NMR, nós podemos medir não apenas a estrutura da proteína, mas a dinâmica de cada segmento nestas moléculas e a dinâmica da interacção. Todos os mecanismos biológicos envolvem interacções entre estas moléculas na pilha: interacções do protein−protein, interacções de RNA−DNA, e igualmente interacções do protein−carbohydrate em moléculas pequenas.

Estas interacções representam todos os mecanismos patológicos e os mecanismos biológicos envolvidos e NMR são muito bons para medir os e os jogos da dinâmica do papel. Neste sentido, NMR é uma ferramenta muito poderosa.

Como as amostras são preparadas para a análise NMR?

Para preparar proteínas, você precisa de seleccionar o gene do − do interesse o gene que é envolvido no mecanismo que patológico ou biológico você é afiado estudar. Você precisa de clonar esse gene nas bactérias ou em um sistema eucariótica. As bactérias são mais de uso geral, mas há diversas opções para genes clonando nestes sistemas heterologous.

Então, você expressa esta proteína, que o permite do etiquetar com um isótopo. Você pode alcançar a proteína com nitrogênio 15, carbono 13, deutério, e talvez outros núcleos que são envolvidos neste mecanismo biológico. Contudo, estes são os três núcleos magnètica activos que são importantes para fazer medidas NMR.

Após ter etiquetado e ter refinado a proteína, você então tem que estabelecer as condições do trabalho para fazer os estudos NMR. Você tem que ajustar a temperatura, o pH e imitar as circunstâncias fisiológicos de tão perto quanto possível. Então, você pode testar o efeito dos osmolytes e o efeito da alta pressão, por exemplo. Você pode pôr a amostra em circunstâncias diferentes e testar o que acontece então à estrutura e à dinâmica da proteína.

Em resumo, a preparação da amostra envolve clonar o gene, expressar a proteína, etiquetar a proteína com um isótopo, refinar-la e então executar ensaios biológicos para considerar o que as circunstâncias ideais são trabalhando com a proteína.

Como pode a espectroscopia NMR ser usada para estudar a biologia do cancro e pode guiar a revelação de tratamentos novos?

Há um − que são expressados pelos oncogenes assim chamados, os genes de diversas proteínas dos alvos do cancro −mainly que expressam as proteínas envolvidas na formação de tumores. Geralmente, estas proteínas são envolvidas em controlar o ciclo de pilha. A proteína pode ser um supressor do tumor tal como p53, que é envolvido em 50% de todos os cancros. As mutações nesta proteína são responsáveis para dysregulating o ciclo de pilha, que é a causa principal do cancro.

Dizer isso, NMR igualmente foi chave a compreender o papel biológico, assim como a estrutura e a dinâmica de p53, assim que um número de artigos nesta proteína foram publicados.

NMR é original neste sentido, porque você pode igualmente sondar outros efeitos, tais como a agregação. Há um grupo em nossa universidade que estuda a agregação p53 e em como permite a revelação e a transformação da pilha essa resultados na formação do cancro.

NMR é original porque você pode sondar os efeitos na solução, se esteja determinando a estrutura, medindo a dinâmica, ou pondo proteínas sob o esforço às condições de teste, por exemplo. Nós igualmente temos os grupos nesta facilidade que estudam outros alvos cancro-relacionados tais como Grb2, um outro modulador do ciclo de pilha. Há realmente muito mais exemplos que eu poderia alistar aqui.

Imagem que mostra proteínas na superfície da pilha, que pode ser analisada usando a espectroscopia NMR.urfin | Shutterstock

Que você procura ao escolher a instrumentação nova para seu laboratório?

Primeiramente, você deve pensar muito com cuidado sobre o que o objetivo científico é e ser muito exacto sobre o que o espectrómetro está indo ser usado para. Se o espectrómetro está indo ser usado para usos gerais, há uma possibilidade muito alta que os erros estarão feitos. Você não precisa de ser demasiado específico, mas é bom decidir se a máquina está indo ser usada para analisar a estrutura e a dinâmica ou moléculas pequenas, por exemplo.

Uma vez que você é claro sobre o objetivo científico e o que o instrumento está indo ser usado para, a seguir você pode igualmente ser claro ao decidir no campo magnético, que determina pela maior parte quanto o custo será. Às vezes, é muito melhor usar três espectrómetros com mais baixos campos que custariam a mesma quantidade como a utilização de um instrumento mais alto do campo, assim que este é muito um aspecto importante a considerar.

Em seguida, você precisa de escolher a eletrônica. Você tem que localizar cada detalhe da eletrônica a fim fazer o ideal do espectrómetro para o que você o está usando para. Você precisa de decidir quantos canais você precisa, com base em quantos núcleos você está indo medir. Aqui, por exemplo, todos nossos espectrómetros têm quatro canais, porque nós medimos protão, nitrogênio 15, carbono 13, e deutério… embora não todos precise quatro canais. Você igualmente precisa de decidir no pulso e conseqüentemente na potência que você se estará usando para cada canal. Você pode precisar os pulsos muito curtos, significando o necessidade a potência ser alto, por exemplo.

Uma vez que você escolheu e instalou a eletrônica, você deve testar se se está comportando a maneira que você a precisa a. Você precisa de configurá-la de acordo com as especificações da empresa em relação à estabilidade do campo magnético, estabilidade do campo do pulso e assim por diante.

A manutenção é igualmente muito importante, especialmente para nós, sendo em Brasil e até agora de Europa e dos Estados Unidos onde os centros os mais grandes estão. Você precisa de verificar se a empresa tenha um grupo de manutenção em seu país, isso poderia resolver todos os problemas com a eletrônica, por exemplo, e igualmente ajuda-o às vezes com a experiência. Esta parceria com a empresa é muito importante.

Um outro aspecto importante é envolver alguém que é um perito no campo de NMR, qualquer um um gerente NMR que tenha um Ph.D. em NMR ou alguém que são especializadas em usar o espectrómetro NMR. Isto é tão importante quanto a qualidade do equipamento.

Que faz um espectrómetro NMR de Bruker estar para fora dos outros espectrómetros NMR no mercado?

Em nosso centro NMR, nós temos seis espectrómetros NMR de Bruker de diversas forças de campo magnético. Bruker fornece o equipamento da boa qualidade que está melhorando sempre com o passar do tempo. Os ímãs são altamente homogéneos e o estábulo e usam somente baixas quantidades de hélio, que é caro.

A eletrônica é igualmente de alta qualidade e nós podemos geralmente alcançar os coordenadores de Bruker, que o falam através dos detalhes em relação à eletrônica que você precisa.

Também, quando nós estamos em Brasil, nós precisamos realmente esta parceria com a empresa, que em nosso caso, assegura os trabalhos do equipamento dia-e-noite. Se você investe em um espectrómetro, você precisa de certificar-se que está indo trabalhar 24/7 e não é apenas os gerentes no centro NMR que são responsáveis para aquele, mas igualmente o grupo de manutenção em Bruker.

Esta parceria e o serviço ao cliente/suporte laboral fornecido são muito importantes e necessidades ser considerado antes que você escolha de que a empresa você está indo comprar seu espectrómetro.

Sobre Fábio Almeida

Fabio BIO

Fabio C.L. Almeida é um perito na estrutura e na dinâmica da proteína pela ressonância magnética nuclear (NMR). Descobriu a estrutura de diversas proteínas por NMR. Igualmente fez as descobertas importantes numerosas que cercam a estrutura e a dinâmica de defensins da planta.

Fabio e seu grupo mostraram aquele apesar da dobradura conservada, indicador dos defensins uma variação larga na dinâmica, que permitiu o traço de regiões obrigatórias e a descrição do mecanismo do reconhecimento da membrana.

O grupo igualmente mostrou que a dinâmica é igualmente a chave para a compreensão do mecanismo do reconhecimento da membrana de peptides antimicrobiais. O pedido preexistente em peptides flexíveis permite a discriminação entre as regiões de emperramento específico e não específico.

O grupo de Fabio igualmente descreveu a estrutura e a dinâmica da cavidade da água do thioredoxin, que é um elemento estrutural essencial para a catálise. Fabio é o director do centro nacional de NMR (CNRMN) e do presidente da associação NMR brasileira (AUREMN).

Citations

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    Bruker BioSpin - NMR, EPR and Imaging. (2019, July 04). Utilização NMR para estudar a estrutura, a dinâmica e os mecanismos da proteína. News-Medical. Retrieved on October 24, 2021 from https://www.news-medical.net/news/20190704/Using-NMR-to-Study-Protein-Structure-Dynamics-and-Mechanisms.aspx.

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