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Usando el RMN para estudiar la estructura, la dinámica y mecanismos de la proteína

Fábio AlmeidaNational NMR CenterFederal University of Rio de Janeiro

Una entrevista con Fábio Almeida, describiendo el trabajo él hace en la universidad de Rio de Janeiro en el centro nacional del RMN, implicando la estructura y la dinámica de proteínas.

¿Pueden usted presentarse por favor y la investigación que usted realiza en la universidad federal de Rio de Janeiro?

Mi nombre es Fábio Almeida. Trabajo en la universidad federal de Rio de Janeiro en el centro nacional del RMN, que es parte del centro de la biología estructural y de Bioimaging.

Esta instalación multiusos está abierta a varios utilizadores dentro de la universidad y también a ésas de otras universidades e instituciones de investigación en el Brasil y en el extranjero. Nuestros espectrómetros del RMN se contienen en la unidad estructural de la biología, pero también tenemos otras unidades disponibles para bioimaging de pequeños animales y de microscopia.

Mi investigación se centra en tres temas. Todos implican la estructura y la dinámica de proteínas, con el foco principal en el papel de la dinámica y de los mecanismos de la proteína.

NMR in Cancer Studies

RMN en estudios del cáncer de AZoNetwork en Vimeo.

Estudio el thioredoxin, que es una proteína muy bien-sabida. La estructura fue resuelta hace más de tres décadas, pero hay los elementos todavía dinámicos y estructurales que necesitan ser descritos. Recientemente, describimos uno de estos elementos dinámicos; ésa es la cavidad del agua que es esencial y dominante al mecanismo biológico de la proteína.

También estudiamos el thioredoxin en eucariotas más altos, que tenían un avance del − de la función la capacidad de realizar modificaciones poste-de translación, tales como oscilaciones y dilataciones transitorias. El mecanismo que media la oscilación transitoria muy bien-no se sabe, así que nosotros utiliza el RMN para estudiar este mecanismo.

La otra parte de nuestro trabajo implica las proteínas del capsid del flavivirus. Describimos el mecanismo obligatorio de las proteínas del capsid del virus de dengue a las gotitas intracelulares del lípido, que se relaciona con el metabolismo de lípido. Este atascamiento es esencial, así que utilizamos el RMN para correlacionar la acción recíproca de esta proteína del capsid del virus de dengue con estas gotitas del lípido. Puesto que el atascamiento es esencial, sabemos que éste podría verter la luz en cómo desarrollar las nuevas composiciones que pueden prevenirla.

Más recientemente, hemos estado estudiando las proteínas del capsid del virus de Zika, para las cuales acabamos de resolver la estructura. Estamos haciendo estudios similares en la acción recíproca de las proteínas del capsid del virus de Zika con las moléculas intracelulares, para mediar su mecanismo biológico.

Todas estas acciones recíprocas implican la dinámica de estas proteínas del capsid del flavivirus, así que el RMN es único a y muy importante para tales estudia.

¿Cómo el RMN se utiliza para estudiar la estructura de la proteína?

El RMN es uno de los tres métodos usados para estudiar la estructura de la proteína, los otros que son cristalografía de la radiografía y cryomicroscopy. El RMN es el único método que permite a los estudios conducto en la solución, que es muy importante. El RMN se puede también utilizar para realizar estudios de estado sólido.

El RMN es especial y único porque usted puede estudiar no sólo la estructura pero también la dinámica de una proteína. Usando el RMN, podemos medir la propiedad dinámica de cada núcleo en la proteína, que es muy importante, porque el dinámico se relaciona íntimo con el mecanismo biológico de la proteína.

Recientemente, tiene sido una revolución en la biología estructural que implica microscopia del cryo-electrón. Este método permite a las estructuras de complejos moleculares más altos ser resueltas, que es muy importante.

El RMN desempeña un papel muy importante en esta nueva área de la biología estructural porque es el único método que habilita los estudios de dinámicas. Por ejemplo, los dominios múltiples considerados en algunas proteínas son un avance de la función en la evolución, así que son muy importantes y el RMN puede ayudarnos a entender el movimiento de estos dominios.

El treinta por ciento del genoma tiene lo que llamamos las regiones intrínseco desordenadas, que son los segmentos de la proteína que no tienen una estructura única. Importantemente, una región intrínseco desordenada es real un punto de la adaptabilidad.

En este sentido, el RMN es otra vez tan único que es el único método que nos permite entender estas máquinas para hacer chorizos dentro de las proteínas del multidomain. Estas máquinas para hacer chorizos están también presentes en proteínas más pequeñas. Podemos también llamarlas las “máquinas para hacer chorizos entrópicas,” porque contribuyen a la entropía del sistema y son dominantes al mecanismo biológico.

RMN Fabio

¿Por qué esto importante en el contexto de patógeno humanos y de las proteínas está implicada en causar enfermedad?

Toda la patogenesia es realizada por el − de las proteínas y de los ácidos nucléicos quizás su asociación el uno con el otro y, a veces, el reconocimiento de hidratos de carbono y los polisacáridos. El RMN es único porque podemos utilizar propiedades él para observar y de la dimensión directamente en el nivel atómico.

Para todas estas macromoléculas biológicas (proteínas, hidratos de carbono, y ácidos nucléicos), el RMN es uno de los métodos principales para sondar y hacer preguntas biológicas.

Con el RMN, podemos medir no apenas la estructura de la proteína, pero la dinámica de cada segmento en estas moléculas y la dinámica de la acción recíproca. Todos los mecanismos biológicos implican acciones recíprocas entre estas moléculas en la célula: acciones recíprocas del protein−protein, acciones recíprocas de RNA−DNA, y también acciones recíprocas del protein−carbohydrate en pequeñas moléculas.

Estas acciones recíprocas representan todos los mecanismos patológicos y los mecanismos biológicos implicados y el RMN es muy buenos para medir los y los juegos de la dinámica del papel. En este sentido, el RMN es una herramienta muy potente.

¿Cómo las muestras se preparan para el análisis del RMN?

Para preparar las proteínas, usted necesita seleccionar el gen del − del interés el gen que está implicado en el mecanismo patológico o biológico que usted es afilado estudiar. Usted necesita reproducir ese gen en bacterias o un sistema eucariótico. Las bacterias se utilizan generalmente, pero hay varias opciones para los genes de clonación en estos sistemas heterólogos.

Entonces, usted expresa esta proteína, que le permite etiqueta lo con un isótopo. Usted puede alcanzar la proteína con el nitrógeno 15, el carbono 13, el deuterio, y quizá otros núcleos que estén implicados en este mecanismo biológico. Sin embargo, éstos son los tres núcleos magnético activos que son importantes para hacer mediciones del RMN.

Después de etiqueta y de purificar la proteína, usted entonces tiene que fijar las condiciones del trabajo para hacer los estudios del RMN. Usted tiene que fijar la temperatura, el pH e imitar las condiciones fisiológicas lo más posible. Entonces, usted puede probar el efecto de osmolytes y el efecto de la alta presión, por ejemplo. Usted puede poner la muestra en diversas condiciones y probar qué entonces suceso a la estructura y a la dinámica de la proteína.

En resumen, la preparación de la muestra implica el reproducir del gen, el expresar de la proteína, el etiqueta de la proteína con un isótopo, el purificar de ella y después el realizar de análisis biológicos para considerar cuáles son las condiciones ideales para trabajar con la proteína.

¿Cómo se puede la espectroscopia del RMN utilizar para estudiar biología del cáncer y puede conducir el revelado de nuevos tratamientos?

Hay − que son expresados por los supuestos oncogenes, los genes de varias del cáncer proteínas de los objetivos −mainly que expresan las proteínas implicadas en la formación de tumores. Generalmente, estas proteínas están implicadas en controlar el ciclo celular. La proteína puede ser un supresor del tumor tal como p53, que está implicado en el 50% de todos los cánceres. Las mutaciones en esta proteína son responsables de dysregulating el ciclo celular, que es la causa principal del cáncer.

Diciendo eso, el RMN también ha sido dominante a entender el papel biológico, así como la estructura y la dinámica de p53, así que varios artículos sobre esta proteína se han publicado.

El RMN es único en este sentido, porque usted puede también sondar otros efectos, tales como agregación. Hay un grupo en nuestra universidad que estudie la agregación p53 y cómo habilita el revelado y la transformación de la célula esa los resultados en la formación del cáncer.

El RMN es único porque usted puede sondar los efectos en la solución, si esté determinando la estructura, midiendo la dinámica, o poniendo las proteínas bajo tensión a las condiciones de prueba, por ejemplo. También tenemos los grupos en esta instalación que estudian otros objetivos cáncer-relacionados tales como Grb2, otro modulador del ciclo celular. Hay real muchos más ejemplos que podría enumerar aquí.

Imagen que muestra las proteínas en la superficie de la célula, que se puede analizar usando la espectroscopia del RMN.urfin | Shutterstock

¿Qué usted busca al elegir la nueva instrumentación para su laboratorio?

Primero, usted debe pensar muy cuidadosamente sobre cuál es la meta científica y ser muy exacto sobre para lo que va el espectrómetro a ser utilizado. Si el espectrómetro va a ser utilizado para los fines generales, hay una ocasión muy alta que equivocaciones serán incurridas en. Usted no necesita ser demasiado específico, pero es bueno decidir a si la máquina va a ser utilizada para analizar la estructura y dinámica o las pequeñas moléculas, por ejemplo.

Una vez que usted está sin obstrucción sobre la meta científica y para qué el instrumento va a ser utilizado, después usted puede también estar sin obstrucción al decidir sobre el campo magnético, que determina en gran parte cuánto será el costo. A veces, es mucho mejor utilizar tres espectrómetros con campos más inferiores que costarían la misma cantidad como usando un instrumento más alto del campo, así que esto es mismo un aspecto importante a considerar.

Después, usted necesita elegir la electrónica. Usted tiene que establecer claramente cada detalle de la electrónica para hacer el ideal del espectrómetro para lo que usted lo está utilizando. Usted necesita decidir cuántos canales usted necesita, sobre la base de cuántos núcleos usted va a medir. Aquí, por ejemplo, todos nuestros espectrómetros tienen cuatro canales, porque medimos los protones, el nitrógeno 15, el carbono 13, y el deuterio… aunque no todos necesite cuatro canales. Usted también necesita decidir sobre el pulso y por lo tanto la potencia que usted utilizará para cada canal. Usted puede necesitar los pulsos muy cortos, significándole necesidad la potencia de ser alto, por ejemplo.

Una vez que usted ha elegido y ha instalado la electrónica, usted debe probar si se está comportando la manera que usted la necesita a. Usted necesita configurarla de acuerdo con los pliegos de condiciones de la compañía con respecto a la estabilidad del campo magnético, estabilidad del campo del pulso y así sucesivamente.

El mantenimiento es también muy importante, especialmente para nosotros, siendo en el Brasil y hasta ahora de Europa y de los Estados Unidos donde están los centros más grandes. Usted necesita verificar si la compañía tenga una dotación de mantenimiento en su país, eso podría resolver cualquier problema con la electrónica, por ejemplo, y también le ayuda a veces con el experimento. Esta sociedad con la compañía es muy importante.

Otro aspecto importante es implicar alguien que es un experto en la materia del RMN, cualquier un gerente del RMN que tenga un Ph.D. en el RMN o alguien que se especializa al usar el espectrómetro del RMN. Esto es tan importante como la calidad del equipo.

¿Qué hace que un espectrómetro del RMN de Bruker se destaca de los otros espectrómetros del RMN en el mercado?

En nuestro centro del RMN, tenemos seis espectrómetros de Bruker RMN de varias fuerzas de campo magnético. Bruker ofrece el equipo de la buena calidad que está perfeccionando siempre con el paso del tiempo. Los imanes son altamente homogéneos y el establo y ellos utilizan solamente periodos inferiores del helio, que es costoso.

La electrónica está también de alta calidad y podemos generalmente llegar hasta a los ingenieros de Bruker, que le hablan a través de los detalles con respecto a la electrónica que usted necesita.

También, cuando estamos en el Brasil, necesitamos realmente esta sociedad con la compañía, que en nuestro caso, asegura los trabajos del equipo las veinticuatro horas del día. Si usted invierte en un espectrómetro, usted necesita asegurarse de que vaya a trabajar 24/7 y no es apenas los gerentes en el centro del RMN que son responsables de ése, pero también la dotación de mantenimiento en Bruker.

Esta sociedad y el servicio de atención al cliente/el soporte técnico proporcionado es muy importantes y necesidades ser considerado antes de que usted elija de quien la compañía usted va a comprar su espectrómetro.

Sobre Fábio Almeida

Fabio BIO

Fabio C.L. Almeida es un experto en estructura y dinámica de la proteína por de resonancia magnética nuclear (NMR). Él ha destapado la estructura de varias proteínas por el RMN. Él también ha hecho los descubrimientos importantes numerosos que rodeaban la estructura y la dinámica de los defensins de la instalación.

Fabio y su grupo mostraron eso a pesar del plegamiento conservado, despliegue de los defensins una amplia variación en la dinámica, que habilitó la correspondencia de regiones obligatorias y la descripción del mecanismo del reconocimiento de la membrana.

El grupo también mostró que las dinámicas son también la llave para la comprensión del mecanismo del reconocimiento de la membrana de péptidos antimicrobianos. La orden preexistente en péptidos flexibles permiso la discriminación entre las regiones de atascamiento específico y no específico.

El grupo de Fabio también describió la estructura y la dinámica de la cavidad del agua del thioredoxin, que es un elemento estructural esencial para la catálisis. Fabio es el director del centro nacional de RMN (CNRMN) y del presidente de la asociación brasileña del RMN (AUREMN).

Citations

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    Bruker BioSpin - NMR, EPR and Imaging. (2019, July 04). Usando el RMN para estudiar la estructura, la dinámica y mecanismos de la proteína. News-Medical. Retrieved on October 20, 2021 from https://www.news-medical.net/news/20190704/Using-NMR-to-Study-Protein-Structure-Dynamics-and-Mechanisms.aspx.

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