Enzima di RNA-taglio di CRISPR programmato per distruggere i virus in cellule umane

Molti del mondo più comune o degli agenti patogeni umani micidiali sono a virus basati a RNA -- Ebola, Zika ed influenza, per esempio -- e la maggior parte non hanno trattamenti approvati dalla FDA. Un gruppo piombo dai ricercatori al vasto istituto del MIT e di Harvard ora ha trasformato un enzima di RNA-taglio di CRISPR in un antivirale che può essere programmato per individuare e distruggere ai i virus basati a RNA in cellule umane.

I ricercatori precedentemente hanno adattato l'enzima Cas13 come strumento per tagliare e modificare il RNA umano e come sistema diagnostico per individuare la presenza di virus, di batteri, o di altri obiettivi. Questo studio è un del primo per sfruttare Cas13, o tutto il sistema di CRISPR, come un antivirale in cellule umane coltivate.

I ricercatori hanno combinato l'attività antivirale di Cas13 con la sua capacità diagnostica per creare un singolo sistema a cui può l'un giorno essere usato sia diagnostica che tratta un'infezione virale, compreso le infezioni causate dai nuovi e virus emergenti. Il loro sistema, chiamato CARVER (restrizione di Cas13-Assisted dell'espressione e della lettura virali), è descritto oggi in cella molecolare.

Il lavoro era guidato co da Pardis senior Sabeti autore, dal membro dell'istituto al vasto istituto e da professore alla Harvard University e il co-primo crea Catherine Freije, un dottorando alla Harvard University nel laboratorio di Sabeti e Cameron Myhrvold, un postdoc egualmente nel laboratorio di Sabeti.

Gli agenti patogeni virali umani sono estremamente diversi e costantemente adattantesi al loro ambiente, anche all'interno dell'singole specie di virus, che sottolinea sia la sfida che l'esigenza delle piattaforme antivirali flessibili. Il nostro lavoro stabilisce CARVER come tecnologia diagnostica ed antivirale potente e rapido programmabile per un'ampia varietà di questi virus.„

Pardis Sabeti, ricercatore di Howard Hughes Medical Institute

Begone del virus

L'esigenza di nuovi approcci antivirali è urgente. Durante i 50 anni scorsi, 90 droghe antivirali clinicamente approvate sono state prodotte, ma trattano soltanto nove malattie -- e gli agenti patogeni virali possono evolvere rapido la resistenza al trattamento. Soltanto 16 virus hanno vaccini approvati dalla FDA.

Per esplorare le nuove strategie antivirali, il gruppo ha messo a fuoco su Cas13, che mira naturalmente al RNA virale in batteri. L'enzima può essere programmato per mirare alle sequenze specifiche di RNA con poche limitazioni, è relativamente facile da ottenere nelle celle ed è stato ben esaminato in cellule di mammiferi dai ricercatori compreso il vasto membro Feng Zhang di memoria dell'istituto.

Il gruppo in primo luogo ha schermato una serie ai dei virus basati a RNA alla ricerca delle sequenze virali del RNA a che Cas13 potrebbe mirare efficientemente. Soprattutto hanno cercato i pezzi che sono sia il più minimo probabili subire una mutazione che molto probabilmente, una volta tagliati, per rendere non valido un virus.

“Nella teoria, potreste programmare Cas13 per attaccare virtualmente qualsiasi parte di un virus,„ spiegate Myhrvold. “Ma c'è diversità enorme all'interno di e fra le specie e gran parte del genoma cambia rapido mentre un virus si evolve. Se non state attento, potreste andare dopo che un obiettivo che infine non avrà effetto.„

I ricercatori hanno identificato informaticamente migliaia di siti, nelle centinaia di specie virali, che potrebbero essere efficaci obiettivi per Cas13.

Sistema di tre in uno

Con una lista degli obiettivi virali potenziali del RNA a disposizione, il gruppo potrebbe poi programmare Cas13 per cercare e tagliare qualcuno di questi sequenze dell'acido nucleico costruendo il RNA della guida degli enzimi.

I ricercatori hanno verificato sperimentalmente l'attività di Cas13 in cellule umane infettate con uno di tre a virus basati a RNA distinti: virus linfocitario di choriomeningitis (LCMV), virus di influenza A (IAV) e virus di stomatite vescicolare (VSV). Hanno presentato il gene Cas13 e un RNA costruito della guida nelle celle e 24 ore più successivamente, ha esposto le celle al virus. Dopo altre 24 ore, gli enzimi Cas13 avevano diminuito il livello di RNA virale nelle colture cellulari dalla volta fino a 40.

Ulteriore Cas13 effetto esplorato del gruppo su infettività del virus -- cioè quanto del virus restante potrebbe realmente continuare ad infettare le cellule umane. I dati hanno indicato che otto ore dopo l'esposizione virale, Cas13 aveva diminuito l'infettività del virus di influenza più di dalla volta 300.

Per aggiungere una componente diagnostica, i ricercatori egualmente hanno compreso la tecnologia SHERLOCK di rilevazione dell'acido nucleico di Cas13-based. Il sistema risultante di CARVER ha potuto misurare rapido i livelli restanti di RNA virale in un campione.

“Prevediamo Cas13 come strumento della ricerca per esplorare molti aspetti di biologia virale in cellule umane,„ dice Freije. “Potrebbe anche potenzialmente essere uno strumento clinico, in cui questi sistemi potrebbero essere usati per diagnosticare un campione, per trattare un'infezione virale e per misurare l'efficacia del trattamento -- tutti con la capacità di adattare rapidamente CARVER per trattare con i nuovi o virus resistenti alla droga come emergono.„