Enzima da RNA-estaca de CRISPR programada para destruir vírus em pilhas humanas

Muitos do mundo o mais comum ou dos micróbios patogénicos humanos mortais são vírus RNA-baseados -- Ebola, Zika e gripe, por exemplo -- e a maioria não têm nenhum tratamento aprovado pelo FDA. Uma equipe conduzida por pesquisadores no instituto largo do MIT e do Harvard tem transformado agora uma enzima da RNA-estaca de CRISPR em um antiviral que pudesse ser programado para detectar e destruir vírus RNA-baseados em pilhas humanas.

Os pesquisadores têm adaptado previamente a enzima Cas13 como uma ferramenta para cortar e editar o RNA humano e como um diagnóstico para detectar a presença de vírus, de bactérias, ou de outros alvos. Este estudo é um do primeiro para aproveitar Cas13, ou todo o sistema de CRISPR, como um antiviral em pilhas humanas cultivadas.

Os pesquisadores combinaram a actividade antivirosa de Cas13 com sua capacidade diagnóstica para criar um único sistema a que pudesse um dia ser usado diagnosticasse e tratasse uma infecção viral, incluir as infecções causadas por vírus novos e emergentes. Seu sistema, chamado CARVER (limitação de Cas13-Assisted da expressão viral e do Readout), é descrito hoje na pilha molecular.

O trabalho co-foi conduzido por Pardis superior Sabeti autor, por membro do instituto no instituto largo e por professor na Universidade de Harvard, e o co-primeiro é o autor de Catherine Freije, um aluno diplomado na Universidade de Harvard no laboratório de Sabeti, e Cameron Myhrvold, um postdoc igualmente no laboratório de Sabeti.

Os micróbios patogénicos virais humanos são extremamente diversos e constantemente adaptando-se a seu ambiente, mesmo dentro de uma única espécie de vírus, que relevos o desafio e necessidade para plataformas antivirosas flexíveis. Nosso trabalho estabelece CARVER como uma tecnologia diagnóstica e antivirosa poderosa e ràpida programável para uma grande variedade destes vírus.”

Pardis Sabeti, investigador do Howard Hughes Medical Institute

Begone do vírus

A necessidade para aproximações antivirosas novas é urgente. Nos 50 anos passados, 90 drogas antivirosas clìnica aprovadas foram produzidas, mas tratam somente nove doenças -- e os micróbios patogénicos virais podem ràpida evoluir a resistência ao tratamento. Somente 16 vírus têm vacinas aprovados pelo FDA.

Para explorar estratégias antivirosas novas, a equipe focalizou em Cas13, que visa naturalmente o RNA viral nas bactérias. A enzima pode ser programada para visar seqüências específicas do RNA com poucas limitações, é relativamente fácil de obter em pilhas, e foi bem examinada em pilhas mamíferas pelos pesquisadores que incluem o membro largo Feng Zhang do núcleo do instituto.

A equipe seleccionou primeiramente uma série de vírus RNA-baseados à procura das seqüências virais do RNA que Cas13 poderia eficientemente visar. Procuraram primeiramente as partes que são o mais menos prováveis se transformar e muito provavelmente, quando cortadas, para desabilitar um vírus.

“Na teoria, você poderia programar Cas13 para atacar virtualmente qualquer parte de um vírus,” explica Myhrvold. “Mas há uma diversidade enorme dentro e entre da espécie, e muito do genoma muda ràpida enquanto um vírus evolui. Se você não é cuidadoso, você poderia ir depois que um alvo que não tivesse finalmente nenhum efeito.”

Os pesquisadores identificaram computacionalmente milhares de locais, nas centenas de espécies virais, que poderiam ser alvos eficazes para Cas13.

Três--um no sistema

Com uma lista de alvos virais potenciais do RNA à disposição, a equipe poderia então programar Cas13 para procurar e cortar qualqueras um seqüências do ácido nucleico projetando o RNA do guia da enzima.

Os pesquisadores testaram experimental a actividade de Cas13 nas pilhas humanas contaminadas com um de três vírus RNA-baseados distintos: vírus lymphocytic do choriomeningitis (LCMV), vírus da gripe A (IAV), e vírus do stomatitis vesicular (VSV). Introduziram o gene Cas13 e um RNA projetado do guia nas pilhas, e 24 horas mais tarde, exps as pilhas ao vírus. Após outras 24 horas, as enzimas Cas13 tinham reduzido o nível de RNA viral nas culturas celulares pela dobra até 40.

O efeito explorado mais adicional da equipe Cas13 na infectividade do vírus -- ou seja quanto do vírus restante poderia realmente continuar a contaminar pilhas humanas. Os dados indicaram que oito horas após a exposição viral, Cas13 tinha reduzido a infectividade do vírus da gripe mais pela dobra de 300.

Para adicionar um componente diagnóstico, os pesquisadores igualmente incorporaram a tecnologia SHERLOCK da detecção do ácido nucleico de Cas13-based. O sistema resultante de CARVER podia ràpida medir níveis restantes de RNA viral em uma amostra.

“Nós prevemos Cas13 como uma ferramenta da pesquisa para explorar muitos aspectos da biologia viral em pilhas humanas,” diz Freije. “Poderia igualmente potencial ser uma ferramenta clínica, onde estes sistemas poderiam ser usados para diagnosticar uma amostra, para tratar uma infecção viral, e para medir a eficácia do tratamento -- tudo com a capacidade para adaptar rapidamente CARVER para tratar os vírus novos ou resistentes aos medicamentos como emergem.”