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L'enzima migliore Cas9 diminuisce la probabilità delle mutazioni dell'fuori obiettivo CRISPR

Gli esperti in genomica stanno trovando i nuovi modi migliorare l'uso dell'enzima Cas9 per CRISPR chemodificano per diminuire la probabilità delle mutazioni dell'fuori obiettivo. La ricerca, che indirizza le preoccupazioni circa mutagenesi dell'fuori obiettivo ed identifica i nuovi modi migliorare la precisione, recentemente è stata presentata alla società americana della riunione annuale 2019 della genetica umana a Houston.

lJuan Gaertner/Shutterstock.com

Che cosa è Cas9?

Modificare del gene o del genoma permette agli scienziati di alterare il DNA di un organismo aggiungendo, eliminando o cambiando il materiale genetico alle posizioni specifiche nel genoma. Una delle tecnologie gene-modificare più recenti utilizzate nel laboratorio è CRISPR-Cas9.

I ricercatori creano un pezzo di RNA con una breve sequenza “della guida„ che riconosce e lega ad una sequenza specifica del DNA dell'obiettivo. Il RNA della guida egualmente lega all'enzima Cas9, che, a sua volta, lega al DNA dell'obiettivo e lo taglia alla posizione progettata. Una volta che il DNA è tagliato, i ricercatori possono aggiungere o cancellare il materiale genetico o fare i cambiamenti a sostituendo un segmento del DNA con una sequenza su misura del DNA.

Nutter laurico, direttore associato al centro per Phenogenomics a Toronto e collaboratori dal progetto Knockout Phenotyping del mouse dell'multi-istituzione (KOMP2) usa frequentemente il gene Cas9 che modificano per generare le righe del mouse con le mutazioni specifiche.

Mentre effettuano questo editing del gene in laboratorio, si domandano spesso che cosa il rischio di mutagenesi dell'fuori obiettivo è - l'introduzione delle mutazioni genetiche non intenzionali nelle loro righe del mouse.

“Abbiamo voluto sapere: fino a che punto faccia dobbiamo preoccuparci per mutagenesi dell'fuori obiettivo?„ dice Nutter.

Miglioramento gene-modificare umano

Il gruppo ha sperato che se potessero determinare le dimensioni del problema in mouse, li aiutasse meglio per valutare il problema nelle linee cellulari umane e per piombo ai nuovi modi migliorare l'accuratezza di modificare del gene di Cas9-based.

Per studiare, Nutter ed il gruppo hanno effettuato il genoma 58 che modificano gli esperimenti facendo uso di Cas9 e della guida RNAs per indurre una mutazione genetica specifica e mirata a. Due - quattro guide sono state utilizzate in ogni esperimento, che ha aggiunto a complessivamente 175 guida differente RNAs.

I ricercatori hanno eseguito l'intero sequenziamento del genoma di ogni mouse per controllare per vedere se c'è tutte le mutazioni che si trovano fuori del loro obiettivo.

Per ottenere una tariffa di mutazione del riferimento, i genoma delle righe del mouse di Cas9-treated sono stati paragonati a quelli di 25 mouse non trattati di controllo. In 31 delle righe del mouse Cas9, nessuna mutazione dell'fuori obiettivo è stata identificata, ma una media di 2,3 tali mutazioni è stata identificata nelle 20 righe rimanenti.

Tuttavia, fra sia il Cas9-treated che il mouse non trattato allinea, il gruppo ha identificato una media di 3.500 mutazioni naturali in ogni animale.

Sorprendente, questi risultati indicano che il numero delle mutazioni naturali lontano ha superato quelli presentati da Cas9. Egualmente indicano che quando la guida RNAs è progettata correttamente, la mutagenesi dell'fuori obiettivo è abbastanza rara.„

Nutter laurico

I risultati aggiungono il contesto all'uso dei mouse innati del laboratorio

I risultati rinforzano la comprensione circondando l'uso dei mouse innati del laboratorio nella ricerca della genetica ed aggiungono il contesto ai presupposti che i ricercatori hanno fatto mentre effettuano gli esperimenti.

Storicamente, abbiamo usato le righe innate del mouse per studiare la genetica in mouse perché i loro genoma hanno differito soltanto a determinati, posti definiti ed abbiamo supposto che tutta la differenza fra i mouse è dovuto quelle differenze. Tuttavia, abbiamo trovato che anche fra i mouse negli stessi sporchi, là potremmo essere migliaia di differenze genetiche naturali.„

Nutter laurico

Nutter dice che i risultati sottolineano la necessità di essere informati di utilizzare Cas9 ed altri strumenti in un genoma che non può pure essere definito come precedentemente era stato il pensiero.

Dopo, i ricercatori pianificazione studiare se gli enzimi che inibiscono o migliorano la riparazione del DNA possono influenzare la tariffa a cui le nuove mutazioni si presentano. Egualmente intendono valutare il rapporto tra il miglioramento del risparmio di temi di mutagenesi Cas9 ed il miglioramento della sua accuratezza.

Nutter e speranza che del gruppo i loro risultati contribuiranno a piombo allo sviluppo di migliore guida RNAs come pure uso migliore dei gruppi di controllo e una comprensione più informata della progettazione sperimentale.

Questa conoscenza migliore sarebbe particolarmente pertinente in gene che modifica la ricerca con le applicazioni terapeutiche potenziali, compreso ricerca sulla sicurezza e sull'efficacia alle delle terapie basate a genetica, note il gruppo.

Sally Robertson

Written by

Sally Robertson

Sally has a Bachelor's Degree in Biomedical Sciences (B.Sc.). She is a specialist in reviewing and summarising the latest findings across all areas of medicine covered in major, high-impact, world-leading international medical journals, international press conferences and bulletins from governmental agencies and regulatory bodies. At News-Medical, Sally generates daily news features, life science articles and interview coverage.

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