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A enzima Cas9 melhorada reduz a possibilidade de mutações do fora-alvo CRISPR

Os peritos da genómica estão encontrando maneiras novas de melhorar o uso da enzima Cas9 para CRISPR queeditam para reduzir a probabilidade de mutações do fora-alvo. A pesquisa, que endereça interesses sobre mutagêneses do fora-alvo e identifica maneiras novas de melhorar a precisão, foi apresentada recentemente na sociedade americana da reunião anual de genética humana 2019 em Houston.

a enzima cas9 é usada para cortar o ADN na gene-edição de CRISPRJuan Gaertner/Shutterstock.com

Que é Cas9?

A edição do genoma ou do gene permite cientistas de alterar o ADN de um organismo adicionando, removendo ou mudando o material genético em lugar específicos no genoma. Uma das tecnologias deedição mais recentes usadas no laboratório é CRISPR-Cas9.

Os pesquisadores criam uma parte de RNA com uma seqüência curto do “guia” que reconheça e ligue a uma seqüência específica do ADN do alvo. O RNA do guia igualmente liga à enzima Cas9, que, por sua vez, liga ao ADN do alvo e o corta no lugar pretendido. Uma vez que o ADN é cortado, os pesquisadores podem adicionar ou suprimir do material genético ou fazer mudanças a ele substituindo um segmento do ADN com uma seqüência personalizada do ADN.

Nutter Lauryl, director adjunto no centro para Phenogenomics em Toronto e colaboradores do projecto de Phenotyping do rato do KO da multi-instituição (KOMP2) usa freqüentemente o gene Cas9 que editam para gerar linhas do rato com mutações específicas.

Ao realizar este processo de edição do gene no laboratório, querem saber frequentemente o que o risco de mutagênese do fora-alvo é - a introdução de mutações genéticas sem intenção em suas linhas do rato.

“Nós quisemos saber: que extensão faz aos nós precisamos de preocupar-se sobre a mutagênese do fora-alvo?” diz Nutter.

Melhorando a gene-edição humana

A equipe esperou que se poderia determinar a extensão do problema nos ratos, os ajudaria melhor a avaliar o problema em linha celular humanas e ao conduzir às maneiras novas de melhorar a precisão da edição do gene de Cas9-based.

Para investigar, Nutter e a equipe realizaram o genoma 58 que editam experiências usando Cas9 e guia RNAs para induzir um específico, mutação genética visada. Dois a quatro guias foram usados em cada experiência, que adicionou acima a um total 175 do guia diferente RNAs.

Os pesquisadores executaram arranjar em seqüência inteiro do genoma de cada rato para verificar para ver se há todas as mutações que encontram-se fora de seu alvo.

Para obter uma taxa da mutação da linha de base, os genomas de linhas do rato de Cas9-treated foram comparados com os aqueles de 25 ratos não tratados do controle. Em 31 das linhas do rato Cas9, nenhuma mutação do fora-alvo foi identificada, mas uma média de 2,3 tais mutações foi identificada nas 20 linhas permanecendo.

Contudo, entre o Cas9-treated e rato não tratado alinha, a equipe identificou uma média de 3.500 mutações naturais em cada animal.

Surpreendentemente, estes resultados mostram que o número de mutações naturais excedeu distante aqueles introduzidos por Cas9. Igualmente mostram que quando o guia RNAs é projectado correctamente, a mutagênese do fora-alvo é bastante rara.”

Nutter Lauryl

Os resultados adicionam o contexto ao uso de ratos inatos do laboratório

Os resultados reforçam a compreensão cercando o uso de ratos inatos do laboratório na pesquisa da genética e adicionam o contexto às suposições que os pesquisadores fizeram ao realizar as experiências.

Historicamente, nós usamos linhas inatas do rato para estudar a genética nos ratos porque seus genomas diferiram somente em determinados, lugares definidos, e nós supor que toda a diferença entre os ratos é devido 2 aquelas diferenças. Contudo, nós encontramos que mesmo entre ratos no mesmos desarrume, lá poderíamos ser milhares de diferenças genéticas naturais.”

Nutter Lauryl

Nutter diz o relevo dos resultados a necessidade de estar ciente de usar Cas9 e outras ferramentas em um genoma que não possa também ser definido como tinha sido previamente o pensamento.

Em seguida, os pesquisadores planeiam investigar se as enzimas que inibem ou aumentam o reparo do ADN podem influenciar a taxa em que as mutações novas ocorrem. Igualmente pretendem avaliar as trocas entre a aumentação da eficiência da mutagênese Cas9 e o melhoramento de sua precisão.

Nutter e esperança que da equipe seus resultados ajudarão a conduzir à revelação do melhor guia RNAs, assim como uso melhorado de grupos de controle e uma compreensão mais informado do projecto experimental.

Este conhecimento melhorado seria especialmente relevante no gene que edita a pesquisa com aplicações terapêuticas potenciais, incluindo a pesquisa na segurança e na eficácia de terapias genética-baseadas, notas a equipe.

Sally Robertson

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Sally Robertson

Sally has a Bachelor's Degree in Biomedical Sciences (B.Sc.). She is a specialist in reviewing and summarising the latest findings across all areas of medicine covered in major, high-impact, world-leading international medical journals, international press conferences and bulletins from governmental agencies and regulatory bodies. At News-Medical, Sally generates daily news features, life science articles and interview coverage.

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