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Déploiement et totalisation de compréhension d'anticorps monoclonal

Thought LeadersProfessor Wolfgang Frieß Professor of Pharmaceutics and Biopharmaceutics Ludwig Maximilian University

Un anticorps monoclonal thérapeutique et ses éclats ouvriers et de Fc ont été récent vérifiés utilisant la fluorimetrie de balayage différentiel, la dispersion de la lumière dynamique température-en rampe, et les mesures de turbidité.

Dans une entrevue avec des nouvelles médicales et des sciences de la vie, professeur Freiß décrit comment la combinaison des méthodes orthogonales a permis une meilleure compréhension de la stabilité conformationnelle et colloïdale des anticorps monoclonaux.

Pourquoi la stabilité d'anticorps monoclonal est-elle si importante ?

Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont de plus en plus un aspect important de développement de médicament. Comme concentration de protéine dans le mAb thérapeutique les formulations devient plutôt élevée, stabilité est plus d'une édition. La concentration du mAb peut être plus de 150 grammes par litre, et à de telles fortes concentrations, l'attention particulière est exigée pour stabiliser la protéine.

Plusieurs différents aspects doivent être considérés en évaluant la stabilité des mAbs. Les trois zones principales que nous nous orientons sont allumées stabilité chimique ; stabilité conformationnelle, qui est la persistance des structures secondaires et tertiaires ; et également stabilité colloïdale, qui dépend des interactions des molécules de protéine en solution.

Chacun des trois de ces derniers est affecté par la propension du mAb d'agir l'un sur l'autre réversiblement avec d'autres molécules de MAb. De telles associations peuvent mener à la formation de plus grands ensembles, qui influence la stabilité colloïdale. Elle est également liée à la stabilité conformationnelle parce que, lors du déploiement, les parties hydrophobes de la protéine deviennent exposées et sont attirées à leurs homologues en molécules voisines.

Une auto-interaction réversible prononcée, interactive et attrayante peut être augmentée par un événement complémentaire de conformation, de stabilité ou de déploiement. Si l'instabilité conformationnelle se produit, la protéine peut dévoiler. Cependant, s'il y a une interaction répulsive, la totalisation peut forcément ne pas se produire même si le dévoilement se produit. En conclusion, l'auto-interaction réversible peut également affecter l'ampleur de la solubilité du mAb, et entraîne même une augmentation de viscosité aux fortes concentrations. Ceci peut exclure son développement comme formulation injectable.

Notre recherche comporte l'analyse des interactions protéine-protéine par la dispersion de la lumière dynamique et la détermination des effets de la température sur le coefficient de diffusion pour comprendre la totalisation surface-induite de mAb.

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Pouvez-vous expliquer la cotisation des interactions protéine-protéine ?

Bien que les interactions protéine-protéine se produisent aux concentrations inférieures, elles deviennent considérablement plus appropriées aux fortes concentrations. À mesure que la concentration du mAb augmente, fait ainsi la propension et la probabilité des interactions.

Ceci est mentionné comme l'effet de encombrement moléculaire. Il y a plus de volume exclu auquel une molécule individuelle n'a plus accès, et ceci limite sa mobilité.

Les interactions protéine-protéine peuvent être par paires ou non-pairwise, à courte portée ou à longue portée. Ces interactions intermoléculaires sont type déclenchées par les interactions électrostatiques et hydrophobes, qui peuvent également entraîner la formation de boîtier.

Comment étudiez-vous ces interactions utilisant DLS ?

Une interaction de non-pairwise peut être bien étudiée par la dispersion de la lumière dynamique (DLS) comme les changements du diamètre hydrodynamique peuvent être promptement déterminés utilisant DLS.

La technique a été employée, avec la dispersion de la lumière statique, pour évaluer les boîtiers plus grands qui forment en surveillant le diamètre hydrodynamique apparent de l'anticorps. En évaluant les effets de différents sels, on lui a montré que c'était la présence d'un anion qui était important en déclenchant une telle réaction. les anions Négatif-chargés de citrate et de phosphate ont déclenché cette formation de boîtier, alors que la solution tampon positif-chargée d'histidine n'a pas fait. Les interactions se sont également avérées dépendant du pH, avec le diamètre hydrodynamique augmentant de 10 nanomètres à pH5 à environ 22 nanomètres à pH8. Avec la solution tampon d'histidine, cependant, le diamètre hydrodynamique a à peine changé.

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Comment DLS complète-t-il d'autres outils procurables ?

Beaucoup de gens commencent à regarder l'association des anticorps à l'aide de la chromatographie de taille-exclusion. Étudiant 24 formulations différentes de mAb à la concentration différente de pH et de chlorure de sodium, il n'y avait aucun changement de signe UV entre la chromatographie différente d'exclusion de formulations dans la taille. Ainsi, il s'avère qu'il y a seulement un présent de monomère.

Utilisant DLS et fractionnement d'inducteur-flux d'asymétrique-flux, en plus de la chromatographie de taille-exclusion, a indiqué un comportement intéressant de mAb. Faute de sel, le pH a exercé un effet intense sur le radius hydrodynamique. À pH 7 le radius était presque 20 nanomètres, alors qu'à pH5 c'est seulement six nanomètres, qui correspond au monomère. Cette formation de boîtier est supprimée par la présence du chlorure de sodium 70 ou 140 millimolar. Ainsi l'association de mAb, ne peut pas être vue utilisant la chromatographie de taille-exclusion due au tampon ayant une teneur plus élevée en sel et la protéine étant diluées au détecteur.

De plus, DLS peut être employé pour mesurer la force de l'interaction en facilitant l'analyseD de k. En outre, seulement les petits volumes sont nécessaires - nous mesurent vers le bas aux volumes aussi inférieurs que cinq microlitres - et ceci facilite des rampes de la température.

Que pouvons-nous apprendre de déterminer kD avec DLS ?

Nous pouvons dériver kD de la pente du coefficient de diffusion apparent en fonction de la concentration protéique. Une pente positive indique les interactions répulsives nettes, alors qu'une pente de négatif se dirige vers les interactions attrayantes nettes. Le kD  obtenu de cette façon peut alors être comparé aux valeurs de la norme2 A, utilisant des rectifications pour le poids moléculaire, le coefficient de friction, et le volume spécifique.

Nous avons regardé différents anticorps variés dans différentes études et avons essayé de marquer leur kD avec leurs valeurs2 d'A. Utilisant la solution tampon d'histidine, solution tampon de citrate et solution tampon d'acétate, au pH différent et en présence de chlorhydrate de chlorure de sodium ou d'arginine, nous avons prouvé qu'une augmentation de concentration ionique mène à une augmentation de K.D Ce, cependant, est dépendant du pH. À pH 5 il n'y a aucune influence de chose observable de concentration ionique, et les teneursD  en k sont plus élevées qu'à pH 6. Sur pH de extension 4 les interactions deviennent répulsives. Ceci est marqué avec la charge sur la molécule de protéine, signifiant qu'au de pH faible il est plus franchement - chargé, et nous avons des interactions répulsives plus intenses.

Dans de nombreux cas, kD est également marqué avec la viscosité. Il y a des cas cependant où il n'y a aucune corrélation entre kD et viscosité, particulièrement si la viscosité devient réellement élevée.

kD peut être employé comme paramètre pour étudier des anticorps et pour comprendre leur comportement à la forte concentration et comment la viscosité augmente, bien que les études sont conduits aux concentrations inférieures.

Comment kD est-il affecté par la température ?

Il est important d'évaluer les effets de la température sur la propension d'une protéine de dévoiler et totaliser. Utilisant DLS nous pouvons déterminer la température à laquelle la protéine commence à dévoiler, et la totalisation se produit-le la température de la totalisation (t)agg. Quand le kD est plus élevé, la température auquel des débuts de totalisation est plus élevée parce que nous commençons par des interactions plus répulsives. MAbs avec un début inférieurD de k à dévoiler à une plus basse température et à leur propension de former des ensembles est plus élevé. Ainsi, un k inférieurD signifie un T. inférieur.agg De telles études nous aident à sélecter la formulation la plus stable d'un mAb particulier par le recensement que les conditions déstabilisent et qui stabilise.

DLS peut devenir une méthode élogieuse pour des études température-dépendantes, pour supporter des méthodes particulières de rampe de la température comme la calorimétrie à balayage différentiel (DSC). Il peut également être supporté par la température UV-VIS en rampe, la fluorescence, ou l'infrared. Il peut discerner comment les effets diffèrent entre différentes parties d'une molécule. Par exemple, les endroits hydrophobes et hydrophiles dévoileront dans différentes conditions. C'est particulièrement important pour des mAbs en tant que ces derniers comportent les pièces distinctes ouvrières et de Fc.

Vérifier change en ouvrier et la pièce de Fc des anticorps séparé, te permet d'apprendre plus au sujet de la molécule. Avec le cetuximab, une analyse détaillée de DSC a prouvé que la partie ouvrière commence à totaliser dès qu'elle commencera à dévoiler, alors que la pièce de Fc montre deux passages différents. La première partie de dévoilement déjà commence aux températures bien en-dessous de 70 degrés de C, mais n'entraîne pas la totalisation. La totalisation est seulement déclenchée à environ 75 degrés de C, quand le deuxième déploiement commence à se produire.

En ajoutant l'analyse de DLS du cetuximab, nous pourrions voir que le diamètre hydrodynamique augmente considérablement à mesure que les augmentations de la température. Le radius et le k hydrodynamiquesD sont demeurés intact jusqu'à environ 60 degrés de C, le dévoilement alors commence à se produire, et ceci mène à un changement majeur dans le coefficient de diffusion. Signification que nous avons soudainement une plus grande substance, et une diminution considérable de K.D Ceci signifie que les interactions considérables entre les molécules se produisent avant que nous voyions la précipitation apparente. On a observé le comportement assimilé quand la pièce de Fc a été étudiée séparé.

L'analyse de DSC a prouvé que la partie ouvrière a commencé à totaliser au début de n'importe quel événement de déploiement. Cependant, une diminution en kD observé avec DLS comme déploiement a commencé n'a pas été accompagnée de la précipitation considérable. La totalisation se produit aux températures plus haut que 80 degrés de C.

La combinaison des études a indiqué que la stabilité conformationnelle des anticorps monoclonaux est déterminée par la charge nette due aux effets sur des interactions attrayantes et répulsives électrostatiques. La stabilité conformationnelle est ainsi la plus grande à plus d'un pH élevé, sans ou avec du sel, et également à de pH faible avec du sel. le déploiement Température-induit est totalisation déclenchée en exposant les corrections hydrophobes qui négocient une réduction de K.D

La tension mécanique affecte-t-elle également kD ?

Comme avec la contrainte thermique, la tension mécanique, telle que la secousse et l'agitation, peut faire former de grands ensembles. De même, la susceptibilité à la totalisation mécanique-induite est également déterminée par la formulation.

Il y a une hypothèse que ces interactions protéine-protéine sont importantes pour la formation de ces ensembles sur la tension mécanique. L'étude par il a et autres prouvé qu'avec du k plus élevéD, la formation de particules sur la tension de mécanicien et la formulation d'un mAb étaient essentiellement réduites, alors que, si kD était égal à zéro, il y avait formation considérable de particules. Il n'y a pas, nous laissent dire, une ligne réelle de corrélation dans cela, mais il t'indique réellement que l'interaction répulsive peut mener au fait que, sur la tension de mécanique, nous avons moins de totalisation. Nous avons étudié cela.

Nous avons conduit la spectroscopie (IR) infrarouge à la surface adjacente de mAb et ceci a prouvé qu'il y a une formation de film à la surface adjacente.  Nous avons évalué les spectres d'IR, et ils sont très assimilés à ce que nous voyons en solution. Nous ne pouvons pas réellement dire si la protéine est dévoilée ou pas. Nous ne voyons pas un effet de pH sur les spectres d'IR.

La microscopie de cornière de Brewster a montré des boîtiers de protéine dans le film. Vous pourriez même la comparer à la mer arctique où vous pouvez avoir quelques écrans protecteurs et flotteurs de glace sur l'écran protecteur différent de glace, ainsi il superpose tout dans un film de protéine.

Le compactage du film a comme conséquence une certaine formation d'ensemble ou de boîtier. Quand nous secouons le mAb, le pH croissant a comme conséquence une formation plus intense de particules. kD diminue avec l'augmentation du pH. Nous avons, pour cette raison, cette corrélation entre la formation de particules et la teneurD en k que nous pouvons mesurer pour déterminer la propension pour la formation totale à la surface adjacente.

Nous avions l'habitude également DLS pour étudier des conjugués de mAb et fonder cela introduire une partie hydrophobe complémentaire effectue les forces attrayantes plus prononcées et les teneursD en k diminuent. L'analyseD de k nous aide ainsi à comprendre et prévoir le comportement des conjugués aussi bien.

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Pouvez-vous récapituler les recherches de clés ?

En résumé, les mesures de DLS et les mesures2 d'A dans des formulations de mAb nous fournissent l'information sur des interactions protéine-protéine, en particulier, aux conditions de stockage. A2 peut réellement être un chaînon manquant dans la température et relier la totalisation induite de mAb.

Les frais nets répulsifs augmentent à pH faible la stabilité colloïdale, bien qu'on ait également observé une réduction de la stabilité conformationnelle. La totalisation a été pilotée par des interactions hydrophobes. Le couplage des charges utiles hydrophobes différemment chargées a affecté la stabilité colloïdale en grande partie basée sur les effets de charge.

Au sujet de professeur Wolfgang Frieß

Professeur Wolfgang Frieß est un professeur de la pharmacie et du biopharmaceutics chez Ludwig Maximilians Universitaet Munich, Allemagne. Un élément clé de sa recherche vérifie la tige entre le déploiement et la totalisation thermiques des protéines afin d'aider à réduire à un minimum des instabilités conformationnelles et colloïdales dans des formulations thérapeutiques de protéines.

Citations

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