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Spiegamento di comprensione ed aggregazione dell'anticorpo monoclonale

Thought LeadersProfessor Wolfgang Frieß Professor of Pharmaceutics and Biopharmaceutics Ludwig Maximilian University

Un anticorpo monoclonale terapeutico ed i sui frammenti di Fc e favolosi recentemente sono stati studiati facendo uso della fluorimetria di scansione differenziale, dello scattering leggero dinamico temperatura-dilagato e delle misure di torbidezza.

In un'intervista con le notizie mediche e le scienze biologiche, il professor Freiß descritto come la combinazione di metodi ortogonali ha permesso una migliore comprensione della stabilità conformazionale e colloidale degli anticorpi monoclonali.

Perché è la stabilità dell'anticorpo monoclonale così importante?

Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono un aspetto sempre più importante dello sviluppo della droga. Come la concentrazione di proteina in mAb terapeutico le formulazioni sta diventando piuttosto su, la stabilità è più di un'emissione. La concentrazione di mAb può essere di più di 150 grammi per litro ed a tali alte concentrazioni, l'attenzione speciale è richiesta per stabilizzare la proteina.

Vari aspetti differenti devono essere considerati quando valuta la stabilità dei mAbs. Le tre aree che principali mettiamo a fuoco sopra sono la stabilità chimica; stabilità conformazionale, che è la persistenza delle strutture secondarie e terziarie; ed anche stabilità colloidale, che dipende dalle interazioni delle molecole di proteina in soluzione.

Tutti e tre le di questi sono influenzati dalla tendenza del mAb ad interagire reversibilmente con altre molecole di MAb. Tali associazioni possono piombo alla formazione di più grandi cumuli, che urta la stabilità colloidale. Egualmente è collegata alla stabilità conformazionale perché, sopra spiegamento, le parti idrofobe della proteina sono esposte e sono attirate verso le loro controparti in molecole vicine.

Un'auto-interazione reversibile pronunciata, interattiva ed attraente può essere aumentata da un evento supplementare di conformazione, della stabilità o di spiegamento. Se l'instabilità conformazionale accade, la proteina può spiegare. Tuttavia, se c'è un'interazione repellente, l'aggregazione non può necessariamente accadere anche se spiegare accade. Per concludere, l'auto-interazione reversibile può anche pregiudicare le dimensioni della solubilità del mAb e perfino causa un aumento nella viscosità alle alte concentrazioni. Ciò può precludere il suo sviluppo come formulazione iniettabile.

La nostra ricerca comprende l'analisi delle interazioni della proteina-proteina dallo scattering leggero dinamico e la determinazione degli effetti della temperatura sul coefficiente di diffusione per capire dall'l'aggregazione indotta da interfaccia di mAb.

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Potete spiegare il contributo delle proteina-proteina-interazioni?

Sebbene le proteina-proteina-interazioni si presentino alle concentrazioni basse, diventano considerevolmente più pertinenti alle alte concentrazioni. Mentre la concentrazione di mAb aumenta, così fa la tendenza e la probabilità delle interazioni.

Ciò si riferisce a come l'effetto d'ammucchiatura molecolare. C'è più volume escluso a cui una molecola determinata più non ha accesso e questa limita la sua mobilità.

Le interazioni della proteina-proteina possono essere al paio o non-al paio, a corta portata o a lungo raggio. Queste interazioni intermolecolari sono avviate tipicamente dalle interazioni elettrostatiche ed idrofobe, che possono anche causare la formazione del cluster.

Come studiate queste interazioni facendo uso di DLS?

Un'interazione non-al paio può essere studiata piacevolmente dallo scattering leggero dinamico (DLS) come i cambiamenti di diametro idrodinamico possono essere prontamente risoluti facendo uso di DLS.

La tecnica è stata usata, con lo scattering leggero statico, per valutare i più grandi cluster che si formano riflettendo il diametro idrodinamico evidente dell'anticorpo. Valutando gli effetti dei sali differenti, è stato indicato che era la presenza di anione che era importante nell'avviamento deuna tal risposta. Gli anioni caricati negativamente del fosfato e del citrato hanno avviato questa formazione del cluster, mentre la soluzione tampone di carica positiva dell'istidina non ha fatto. Le interazioni egualmente sono risultate dipendenti dal pH, con il diametro idrodinamico che aumenta da 10 nanometri a pH5 a circa 22 nanometri a pH8. Con la soluzione tampone dell'istidina, tuttavia, il diametro idrodinamico appena è cambiato.

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Come DLS complementa altri strumenti disponibili?

Molta gente comincia esaminare l'associazione degli anticorpi usando la cromatografia di dimensione-esclusione. Studiando 24 formulazioni differenti di mAb alla concentrazione differente nel cloruro di sodio e di pH, non c'era cambiamento nel segnale UV fra le formulazioni differenti in cromatografia di esclusione di dimensione. Quindi, sembra che ci sia soltanto un presente del monomero.

Facendo uso di DLS e del frazionamento di campo-flusso di asimmetrico-flusso, oltre alla cromatografia di dimensione-esclusione, ha rivelato un comportamento interessante di mAb. In assenza di sale, il pH ha avuto un forte effetto sul raggio idrodinamico. A pH 7 il raggio era quasi 20 nanometri, mentre a pH5 è soltanto sei nanometri, che corrisponde al monomero. Questa formazione del cluster è soppressa dalla presenza di cloruro di sodio millimolar 70 o 140. Così l'associazione di mAb, non può essere veduta facendo uso della cromatografia di dimensione-esclusione dovuto il buffer che ha un contenuto salino più elevato e la proteina che sono diluiti al rivelatore.

Inoltre, DLS può essere usato per quantificare la resistenza dell'interazione facilitando l'analisiD del K. Inoltre, soltanto i piccoli volumi sono necessari - noi misurano giù ai volumi bassi quanto cinque microliters - e questo facilita le rampe della temperatura.

Che cosa possiamo imparare dalla determinazione del KD con DLS?

Possiamo derivare il KD dal pendio del coefficiente di diffusione evidente in funzione della concentrazione nella proteina. Un pendio positivo indica le interazioni repellenti nette, mentre un pendio della quantità negativa indica verso le interazioni attraenti nette. Il KD  ottenuto in questo modo può poi essere confrontato ai valori di standard2 A, facendo uso delle correzioni per il peso molecolare, il coefficiente di attrito ed il volume specifico.

Abbiamo esaminato i vari anticorpi differenti negli studi differenti ed abbiamo provato a correlare il loro KD con i loro valori2 di A. Facendo uso della soluzione tampone dell'istidina, soluzione tampone del citrato e soluzione tampone dell'acetato, a pH differente ed in presenza del cloruro di sodio o del cloridrato dell'arginina, abbiamo indicato che un aumento nella forza ionica piombo ad un aumento nel K.D Ciò, tuttavia, è dipendente dal pH. A pH 5 non c'è influenza dell'osservabile di forza ionica e gli indiciD  del K sono superiori a a pH 6. Su pH di raggiungimento 4 le interazioni diventano repellenti. Ciò è correlata alla tassa sulla molecola di proteina, significante che all'a basso pH è più positivamente - fatto pagare ed abbiamo più forti interazioni repellenti.

In molti casi, il KD egualmente è correlato alla viscosità. Ci sono casi comunque dove non c'è correlazione fra il KD e la viscosità, particolarmente se la viscosità ottiene realmente alta.

il KD può essere usato come parametro per studiare gli anticorpi e per capire il loro comportamento ad alta concentrazione e come la viscosità aumenta, sebbene gli studi è condotto alle concentrazioni basse.

Come il KD è influenzato dalla temperatura?

È importante valutare gli effetti della temperatura sulla tendenza di una proteina a spiegare e cumulare. Facendo uso di DLS possiamo determinare la temperatura a cui la proteina comincia spiegare e l'aggregazione accade- la temperatura dell'aggregazione (t)agg. Quando il KD è più alto, la temperatura a cui inizio dell'aggregazione è più alta perché stiamo cominciando con le interazioni più repellenti. MAbs con un inizio più bassoD del K spiegare ad una temperatura più insufficiente ed alla loro tendenza formare i cumuli è più alto. Così, un K più bassoD significa un T. più basso.agg Tali studi ci aiutano a selezionare la formulazione più stabile di un mAb particolare identificando che le circostanze stanno destabilizzando e che stanno stabilizzando.

DLS può trasformarsi in in un metodo lusinghiero per gli studi temperatura-dipendenti, supportare i metodi tipici della rampa della temperatura come calorimetria di a scansione differenziale (DSC). Può anche essere supportato da UV-VIS dilagato la temperatura, dalla fluorescenza, o dall'infrarosso. Può distinguere come gli effetti differiscono fra le sezioni differenti di una molecola. Per esempio, le aree idrofobe ed idrofile spiegheranno nelle circostanze differenti. Ciò è particolarmente importante per i mAbs come questi comprende le parti distinte di Fc e favolose.

Lo studio cambia al favoloso e la parte di Fc degli anticorpi esclusivamente, permette che impariate più circa la molecola. Con cetuximab, un'analisi dettagliata di DSC ha indicato che la parte favolosa comincia cumulare non appena comincia spiegare, mentre la parte di Fc mostra due transizioni differenti. La prima parte di spiegare già comincia bene alle temperature inferiore a 70 gradi di C, ma non causa l'aggregazione. L'aggregazione è avviata soltanto a circa 75 gradi di C, quando il secondo spiegamento comincia accadere.

Aggiungendo l'analisi di DLS di cetuximab, potremmo vedere che il diametro idrodinamico aumenta sostanzialmente come gli aumenti di temperatura. Il raggio ed il K idrodinamiciD sono rimanere identicamente fino a circa 60 gradi di C, spiegare poi comincia accadere e questo piombo ad un cambiamento sostanziale nel coefficiente di diffusione. Significato che abbiamo improvvisamente più grandi specie e una considerevole diminuzione nel K.D Ciò significa che le interazioni sostanziali fra le molecole stanno accadendo prima che vediamo la precipitazione notevole. Il simile comportamento è stato osservato quando la parte di Fc è stata studiata esclusivamente.

L'analisi di DSC ha indicato che la parte favolosa ha cominciato cumulare all'inizio di tutto l'evento di spiegamento. Tuttavia, una diminuzione in KD osservato con DLS come lo spiegamento ha cominciato non è stata accompagnata da precipitazione sostanziale. L'aggregazione si presenta alle temperature più superiore 80 gradi di C.

La combinazione di studi ha rivelato che la stabilità conformazionale degli anticorpi monoclonali è determinata dalla tassa netta dovuto gli effetti sulle interazioni attraenti e repellenti elettrostatiche. La stabilità conformazionale è così più grande ad più a pH elevato, senza o con sale ed anche ad a basso pH con sale. da spiegamento indotto da temperatura è l'aggregazione avviata esponendo le toppe idrofobe che mediano una riduzione del K.D

Lo sforzo meccanico egualmente pregiudica il KD?

Come con lo stress termico, lo sforzo meccanico, come l'agitazione e mescolatura, può indurre i grandi cumuli a formarsi. Similmente, la predisposizione dall'all'aggregazione indotta da meccanica egualmente è determinata dalla formulazione.

C'è un'ipotesi che queste proteina-proteina-interazioni sono importanti per la formazione di questi cumuli sopra lo sforzo meccanico. Lo studio vicino et al. ha indicato che con un K superioreD, la formazione della particella sopra lo sforzo del meccanico e una formulazione di un mAb sono state diminuite sostanzialmente, mentre, se il KD fosse uguale a zero, c'era formazione sostanziale della particella. Non c' è, ci lascia dire, una riga reale di correlazione in quello, ma realmente vi dice che l'interazione repellente può piombo al fatto, sopra lo sforzo dei meccanici, che la meno aggregazione. Abbiamo studiato quello.

Abbiamo condotto la spettroscopia (IR) infrarossa all'interfaccia di mAb e questa ha indicato che c'è una formazione della pellicola all'interfaccia.  Abbiamo valutato gli spettri di IR e sono molto simili a cui vediamo in soluzione. Non possiamo realmente dire se la proteina è spiegata oppure no. Non vediamo un effetto di pH sugli spettri di IR.

La microscopia di angolo di Brewster ha mostrato i cluster di proteina all'interno della pellicola. Potreste anche confrontarlo al mare artico in cui potete avere alcuni carter e fluttuazioni del ghiaccio sul carter differente del ghiaccio, in modo da interamente sta sovrapponendosi all'interno di una pellicola della proteina.

La compressione della pellicola provoca una certa formazione del cluster o del cumulo. Quando scuotiamo sul mAb, il pH aumentante provoca la più forte formazione della particella. il KD diminuisce con l'aumento di pH. , Quindi, abbiamo questa correlazione fra formazione della particella e l'indiceD del K che possiamo misurare determinare la tendenza per formazione aggregata all'interfaccia.

Egualmente abbiamo usato DLS per studiare i coniugati di mAb e scoprire che quello introduce una parte idrofoba supplementare rende le forze attraenti più pronunciate e gli indiciD del K diminuiscono. L'analisiD del K ci aiuta così a capire e predire il comportamento dei coniugati pure.

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Potete riassumere i risultati chiave?

Riassumendo, le misure di DLS e le misure2 di A nelle formulazioni di mAb ci forniscono informazioni sulle proteina-proteina-interazioni, in particolare, alle condizioni di stoccaggio. A2 può realmente essere un anello mancante nell'aggregazione indotta interfaccia di mAb e della temperatura.

Le spese nette repellenti a basso pH aumentano la stabilità colloidale, sebbene una riduzione della stabilità conformazionale egualmente sia stata osservata. L'aggregazione è stata determinata dalle interazioni idrofobe. L'accoppiamento dei carichi utili idrofobi diversamente fatti pagare ha pregiudicato la stabilità colloidale principalmente basata sugli effetti della tassa.

Circa il professor Wolfgang Frieß

Il professor Wolfgang Frieß è un professore dei prodotti farmaceutici e del biopharmaceutics a Ludwig Maximilians Universitaet Monaco di Baviera, Germania. Un elemento chiave della sua ricerca sta studiando il collegamento fra lo spiegamento e l'aggregazione termici delle proteine per contribuire a minimizzare le instabilità conformazionali e colloidali nelle formulazioni terapeutiche delle proteine.

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