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Revelação compreensiva e agregação do anticorpo monoclonal

Thought LeadersProfessor Wolfgang Frieß Professor of Pharmaceutics and Biopharmaceutics Ludwig Maximilian University

Um anticorpo monoclonal terapêutico e seus fragmentos fabulosos e de Fc foram investigados recentemente usando o fluorimetry da exploração diferencial, a dispersão de luz dinâmica temperatura-ramped, e as medidas da turbidez.

Em uma entrevista com a notícia médica e as ciências da vida, professor Freiß descrito como a combinação de métodos ortogonais permitiu uma compreensão melhor da estabilidade conformational e coloidal de anticorpos monoclonais.

Por que é a estabilidade do anticorpo monoclonal tão importante?

Os anticorpos monoclonais (mAbs) são um aspecto cada vez mais importante da revelação da droga. Como a concentração de proteína no mAb terapêutico as formulações estão tornando-se um pouco altamente, estabilidade são mais de uma edição. A concentração de mAb pode ser mais de 150 relvados pelo litro, e em tais concentrações altas, a atenção especial é exigida para estabilizar a proteína.

Diversos aspectos diferentes devem ser considerados ao avaliar a estabilidade dos mAbs. As três áreas que principais nós focalizamos estão ligada estabilidade química; estabilidade conformational, que é a persistência de estruturas secundárias e terciárias; e igualmente estabilidade coloidal, que depende das interacções das moléculas de proteína na solução.

Todos os três destes são afectadas pela propensão do mAb interagir reversìvel com outras moléculas do MAb. Tais associações podem conduzir à formação de agregados maiores, que impacta a estabilidade coloidal. É ligada igualmente à estabilidade conformational porque, em cima da revelação, as partes hidrofóbicas da proteína se tornam expor e são atraídas a suas contrapartes em moléculas vizinhas.

Uma auto-interacção reversível pronunciada, interactiva e atractiva pode ser aumentada por uma conformação, por uma estabilidade ou por uma revelação adicional do evento. Se a instabilidade conformational ocorre, a proteína pode desdobrar-se. Contudo, se há uma interacção repulsivo, a agregação não pode necessariamente ocorrer mesmo se se desdobrar ocorre. Finalmente, a auto-interacção reversível pode igualmente afectar a extensão da solubilidade do mAb, e causa mesmo um aumento na viscosidade em concentrações altas. Isto pode impossibilitar sua revelação como uma formulação injectável.

Nossa pesquisa envolve a análise de interacções da proteína-proteína pela dispersão de luz dinâmica e a determinação dos efeitos da temperatura no coeficiente de difusão para compreender a agregação relação-induzida do mAb.

Crédito de imagem: Shutterstock/imagens invertidas

Pode você explicar a contribuição das proteína-proteína-interacções?

Embora as proteína-proteína-interacções ocorram em baixas concentrações, tornam-se consideravelmente mais relevantes em concentrações altas. Enquanto a concentração de mAb aumenta, faz assim a propensão e a probabilidade das interacções.

Isto é referido como o efeito de aglomeração molecular. Há mais volume excluído a que uma molécula individual já não tem o acesso, e esta restringe sua mobilidade.

As interacções da proteína-proteína podem ser por pares ou non-pairwise, de curto prazo ou de longo alcance. Estas interacções intermolecular são provocadas tipicamente pelas interacções electrostáticas e hidrofóbicas, que podem igualmente causar a formação do conjunto.

Como você estuda estas interacções usando DLS?

Uma interacção do non-pairwise pode agradàvel ser estudada pela dispersão de luz dinâmica (DLS) como as mudanças no diâmetro hidrodinâmico podem ser DLS de utilização prontamente determinados.

A técnica foi usada, junto com a dispersão de luz estática, para avaliar os conjuntos maiores que formam monitorando o diâmetro hidrodinâmico aparente do anticorpo. Avaliando os efeitos de sais diferentes, mostrou-se que era a presença de um aníon que fosse importante em provocar tal resposta. os aníons Negativo-cobrados do citrato e do fosfato provocaram esta formação do conjunto, visto que o amortecedor positivo-cobrado do histidine não fez. As interacções foram encontradas igualmente para ser dependente do pH, com o diâmetro hidrodinâmico que aumenta de 10 nanômetros em pH5 a aproximadamente 22 nanômetros em pH8. Com amortecedor do histidine, contudo, o diâmetro hidrodinâmico mudou mal.

ImageCredit: Shutterstock/ustas7777777

Como DLS complementa outras ferramentas disponíveis?

Muitos povos começam olhar a associação dos anticorpos usando a cromatografia da tamanho-exclusão. Estudando 24 formulações diferentes do mAb na concentração diferente do cloreto do pH e de sódio, não havia nenhuma mudança no sinal UV entre a cromatografia diferente da exclusão das formulações em tamanho. Assim, parece que há somente um presente do monómero.

Usar DLS e fraccionamento do campo-fluxo do assimétrico-fluxo, além do que a cromatografia da tamanho-exclusão, revelou um comportamento interessante do mAb. Na ausência do sal, o pH teve um efeito forte no raio hidrodinâmico. No pH 7 o raio era quase 20 nanômetros, visto que em pH5 é somente seis nanômetros, que corresponde ao monómero. Esta formação do conjunto é suprimida pela presença de cloreto de sódio 70 ou 140 millimolar. Assim a associação do mAb, não pode ser considerada usar a cromatografia da tamanho-exclusão devido ao amortecedor que tem um índice de sal mais alto e a proteína que estão sendo diluídos no detector.

Além, DLS pode ser usado para determinar a força da interacção facilitando a análiseD de k. Também, somente os volumes pequenos são necessários - nós medem para baixo aos volumes tão baixos quanto cinco microlitros - e este facilita rampas da temperatura.

Que podemos nós aprender de determinar kD com DLS?

Nós podemos derivar kD da inclinação do coeficiente de difusão aparente em função da concentração da proteína. Uma inclinação positiva indica as interacções repulsivos líquidas, visto que uma inclinação do negativo aponta para as interacções atractivas líquidas. O kD  obtido desta maneira pode então ser comparado aos valores do padrão2 A, usando correcções para o peso molecular, o coeficiente da fricção, e o volume específico.

Nós olhamos vários anticorpos diferentes em estudos diferentes e tentamo-los correlacionar seu kD com seus valores2 de A. Usando o amortecedor do histidine, o amortecedor do citrato e o amortecedor do acetato, no pH diferente e na presença do cloreto de sódio ou do hidrocloro da arginina, nós mostramos que um aumento na concentração iónica conduz a um aumento no K.D Isto, contudo, é pH-dependente. No pH 5 não há nenhuma influência do observable da concentração iónica, e os valoresD  de k são mais altos do que no pH 6. No pH de alcance 4 as interacções tornam-se repulsivos. Isto é correlacionado à carga na molécula de proteína, significando que no pH que mais baixo é mais positivamente - cobrado, e nós temos umas interacções repulsivos mais fortes.

Em muitos casos, kD é correlacionado igualmente à viscosidade. Há uns casos embora onde não há nenhuma correlação entre kD e viscosidade, especialmente se a viscosidade obtem realmente alta.

kD pode ser usado como um parâmetro para estudar anticorpos e para compreender seu comportamento na concentração alta e como a viscosidade aumenta, embora os estudos é conduzido em baixas concentrações.

Como kD é afectado pela temperatura?

É importante avaliar os efeitos da temperatura na propensão de uma proteína desdobrar-se e agregar. Usando DLS nós podemos determinar a temperatura em que a proteína começa se desdobrar, e a agregação ocorre- temperatura da agregação (T)agg. Quando o kD for mais alto, a temperatura em que começos da agregação é mais alta porque nós estamos começando com interacções mais repulsivos. MAbs com um começo mais baixoD de k a desdobrar-se em uma temperatura mais baixa e em sua propensão formar agregados é mais alto. Assim, um k mais baixoD significa um T. mais baixo.agg Tais estudos ajudam-nos a seleccionar a formulação a mais estável de um mAb particular identificando que as circunstâncias estão desestabilizando e que estão estabilizando.

DLS pode transformar-se um método elogioso para estudos temperatura-dependentes, para apoiar métodos típicos da rampa da temperatura como a calorimetria de exploração diferencial (DSC). Pode igualmente ser apoiado pela temperatura UV-VIS ramped, pela fluorescência, ou pelo infravermelho. Pode distinguir como os efeitos diferem entre secções diferentes de uma molécula. Por exemplo, as áreas hidrofóbicas e hidrófilas desdobrar-se-9&z em circunstâncias diferentes. Isto é especialmente importante para mAbs como estes compreende as peças distintas fabulosos e de Fc.

Investigar muda ao fabuloso e a peça de Fc dos anticorpos separada, permite que você aprenda mais sobre a molécula. Com cetuximab, uma análise detalhada de DSC mostrou que a parte fabuloso começa agregar assim que começasse se desdobrar, visto que a peça de Fc mostra duas transições diferentes. A primeira parte de desdobrar-se já começa em temperaturas bem abaixo de 70 graus de C, mas não causa a agregação. A agregação está provocada somente aproximadamente 75 graus de C, quando a segunda revelação começa ocorrer.

Adicionando a análise de DLS do cetuximab, nós poderíamos ver que o diâmetro hidrodinâmico aumenta substancialmente enquanto a temperatura aumenta. O raio e o k hidrodinâmicosD permaneceram inalterados até aproximadamente 60 graus de C, desdobrar-se então começa ocorrer, e este conduz a uma mudança substancial no coeficiente de difusão. Significado de que nós temos subitamente a espécie maior, e uma diminuição considerável no K.D Isto significa que as interacções substanciais entre as moléculas estão ocorrendo antes que nós ver a precipitação visível. O comportamento similar foi observado quando a peça de Fc foi estudada separada.

A análise de DSC mostrou que a parte fabuloso começou agregar no início de toda a revelação do evento. Contudo, uma diminuição em kD observado com o DLS como a revelação começou não foi acompanhada da precipitação substancial. A agregação ocorre em temperaturas mais altamente de 80 graus de C.

A combinação de estudos revelou que a estabilidade conformational de anticorpos monoclonais está determinada pela carga líquida devido aos efeitos em interacções atractivas e repulsivos electrostáticas. A estabilidade Conformational é assim a grande em um pH mais alto, sem ou com sal, e igualmente em mais baixo pH com sal. a revelação Temperatura-induzida é agregação provocada expor as correcções de programa hidrofóbicas que negociam uma redução do K.D

O esforço mecânico igualmente afecta kD?

Como com esforço térmico, o esforço mecânico, tal como a agitação e a agitação, pode fazer com que os grandes agregados formem. Similarmente, a susceptibilidade à agregação mecânico-induzida é determinada igualmente pela formulação.

Há uma hipótese que estas proteína-proteína-interacções são importantes para a formação destes agregados em cima do esforço mecânico. O estudo perto mostrou e outros que com um k mais altoD, a formação da partícula em cima do esforço do mecânico e a formulação de um mAb estiveram reduzidas substancialmente, visto que, se kD era igual a zero, havia uma formação substancial da partícula. Não há, deixa-nos dizer, uma linha real de correlação naquele, mas diz-lhe realmente que a interacção repulsivo pode conduzir ao facto que, em cima do esforço dos mecânicos, nós temos menos agregação. Nós estudamos aquele.

Nós conduzimos a espectroscopia (IR) infravermelha na relação do mAb e esta mostrou que há uma formação do filme na relação.  Nós avaliamos os espectros do IR, e são muito similares ao que nós vemos na solução. Nós não podemos realmente dizer se a proteína está desdobrada ou não. Nós não vemos um efeito do pH nos espectros do IR.

A microscopia do ângulo de Brewster mostrou conjuntos de proteína dentro do filme. Você poderia mesmo compará-la ao mar árctico onde você pode ter alguns protectores e flutuadores do gelo no protector diferente do gelo, assim que está sobrepor toda dentro de um filme da proteína.

A compressão do filme conduz a alguma formação do agregado ou do conjunto. Quando nós agitamos acima o mAb, o pH crescente conduz a uma formação mais forte da partícula. kD diminui com pH crescente. Nós, temos conseqüentemente esta correlação entre a formação da partícula e o valorD de k que nós podemos medir para determinar a propensão para a formação agregada na relação.

Nós igualmente usamos DLS para estudar conjugado do mAb e encontrar isso introduzir uma parte hidrofóbica adicional faz as forças atractivas mais pronunciadas e os valoresD de k diminuem. A análiseD de k ajuda-nos assim a compreender também e prever o comportamento dos conjugado.

ImageCredit: Shutterstock/Design_Cells

Pode você resumir os resultados chaves?

Em resumo, as medidas de DLS e as medidas2 de A em formulações do mAb fornecem-nos a informação em proteína-proteína-interacções, em particular, em condições de armazenamento. O A2 pode realmente ser um elo em falta na agregação induzida relação da temperatura e do mAb.

As cargas líquidas repulsivos no baixo pH aumentam a estabilidade coloidal, embora uma redução da estabilidade conformational seja observada igualmente. A agregação foi conduzida por interacções hidrofóbicas. O acoplamento de cargas úteis hidrofóbicas diferentemente cobradas afectou a estabilidade coloidal baseada na maior parte nos efeitos da carga.

Sobre o professor Wolfgang Frieß

O professor Wolfgang Frieß é um professor do produto farmacêutico e do biopharmaceutics em Ludwig Maximilians Universitaet Munich, Alemanha. Um elemento chave de sua pesquisa está investigando a relação entre a revelação e a agregação térmicas das proteínas a fim ajudar a minimizar instabilidades conformational e coloidais em formulações terapêuticas das proteínas.

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