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Despliegue de comprensión y agregación del anticuerpo monoclonal

Thought LeadersProfessor Wolfgang Frieß Professor of Pharmaceutics and Biopharmaceutics Ludwig Maximilian University

Un anticuerpo monoclonal terapéutico y sus fragmentos fabulosos y de Fc fueron investigados recientemente usando la fluorimetría de la exploración diferencial, la dispersión luminosa dinámica temperatura-en rampa, y mediciones de la turbiedad.

En una entrevista con las noticias médicas y las ciencias de la vida, profesor Freiß descrito cómo la combinación de métodos ortogonales permitió una mejor comprensión de la estabilidad conformacional y coloidal de anticuerpos monoclonales.

¿Por qué es la estabilidad del anticuerpo monoclonal tan importante?

Los anticuerpos monoclonales (mAbs) son un aspecto cada vez más importante del revelado de la droga. Como la concentración de proteína en el mAb terapéutico las formulaciones se están convirtiendo bastante arriba, estabilidad son más de una entrega. La concentración de mAb puede ser más de 150 gramos por litro, y en tales altas concentraciones, la especial atención se requiere para estabilizar la proteína.

Varios diversos aspectos deben ser considerados al fijar la estabilidad de mAbs. Las tres áreas principales que enfocamos prendido están estabilidad química; estabilidad conformacional, que es la persistencia de estructuras secundarias y terciarias; y también estabilidad coloidal, que depende de las acciones recíprocas de las moléculas de proteína en la solución.

Los tres de éstos son afectados por la propensión del mAb a obrar recíprocamente reversible con otras moléculas del MAb. Tales asociaciones pueden llevar a la formación de agregados más grandes, que afecta estabilidad coloidal. También se conecta a la estabilidad conformacional porque, sobre el despliegue, las partes hidrofóbicas de la proteína se exponen y se atraen a sus contrapartes en moléculas vecinas.

Una uno mismo-acción recíproca reversible pronunciada, interactiva y atractiva se puede aumentar por una acción adicional de la conformación, de la estabilidad o del despliegue. Si ocurre la inestabilidad conformacional, la proteína puede revelar. Sin embargo, si hay una acción recíproca repulsiva, la agregación puede no ocurrir necesariamente incluso si ocurre el despliegue. Finalmente, la uno mismo-acción recíproca reversible puede también afectar al fragmento de la solubilidad del mAb, e incluso causa un aumento en viscosidad en las altas concentraciones. Esto puede impedir su revelado como formulación inyectable.

Nuestra investigación implica el análisis de las acciones recíprocas de la proteína-proteína por la dispersión luminosa dinámica y la determinación de los efectos de la temperatura sobre el coeficiente de difusión para entender la agregación interfaz-inducida del mAb.

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¿Puede usted explicar la contribución de proteína-proteína-acciones recíprocas?

Aunque las proteína-proteína-acciones recíprocas ocurran en las concentraciones inferiores, llegan a ser considerablemente más relevantes en las altas concentraciones. Mientras que la concentración de mAb aumenta, hace tan la propensión y la probabilidad de acciones recíprocas.

Se refiere esto como el efecto de apretadura molecular. Hay más volumen excluido al cual una molécula individual tiene no más acceso, y ésta restringe su movilidad.

Las acciones recíprocas de la proteína-proteína pueden estar en parejas o non-pairwise, de corto alcance o de largo alcance. Estas acciones recíprocas intermoleculares son accionadas típicamente por las acciones recíprocas electroestáticas e hidrofóbicas, que pueden también causar la formación del atado.

¿Cómo usted estudia estas acciones recíprocas usando DLS?

Una acción recíproca del non-pairwise se puede estudiar agradable por la dispersión luminosa dinámica (DLS) como los cambios en el diámetro hidrodinámico pueden ser fácilmente resueltos usando DLS.

La técnica fue utilizada, junto con la dispersión luminosa estática, para evaluar los atados más grandes que forman vigilando el diámetro hidrodinámico evidente del anticuerpo. Evaluando los efectos de diversas sales, fue mostrado que era la presencia de un anión que era importante en accionar tal reacción. los aniones Negativo-cargados del citrato y del fosfato accionaron esta formación del atado, mientras que no lo hizo el almacenador intermedio positivo-cargado de la histidina. Las acciones recíprocas también fueron encontradas para ser dependiente del pH, con el diámetro hidrodinámico aumentando a partir de 10 nanómetros en pH5 a cerca de 22 nanómetros en pH8. Con el almacenador intermedio de la histidina, sin embargo, el diámetro hidrodinámico cambió apenas.

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¿Cómo DLS complementa otras herramientas disponibles?

Mucha gente comienza a observar la asociación de anticuerpos usando la cromatografía de la talla-exclusión. Estudiando 24 diversas formulaciones del mAb en diversa concentración del cloruro del pH y de sodio, no había cambio en señal ULTRAVIOLETA entre las diversas formulaciones en cromatografía de la exclusión de la talla. Así, aparece que hay solamente un presente del monómero.

Usando DLS y el fraccionamiento del campo-flujo del asimétrico-flujo, además de la cromatografía de la talla-exclusión, reveló un comportamiento interesante del mAb. En ausencia de la sal, el pH tenía un efecto fuerte sobre el radio hidrodinámico. En pH 7 el radio era casi 20 nanómetros, mientras que en pH5 es solamente seis nanómetros, que corresponde al monómero. Esta formación del atado es suprimida por la presencia de cloruro de sodio millimolar 70 o 140. Así la asociación del mAb, no se puede considerar usando la cromatografía de la talla-exclusión debido al almacenador intermedio que tiene un contenido en sal más alto y la proteína que son diluidos en el detector.

Además, DLS se puede utilizar para cuantificar la fuerza de la acción recíproca facilitando análisisD de k. También, solamente los pequeños volúmenes son necesarios - nosotros miden hacia abajo a los volúmenes de hasta sólo cinco microlitros - y éste facilita rampas de la temperatura.

D ¿Qué podemos aprender de determinar k con DLS?

Podemos derivar kD del declive del coeficiente de difusión evidente en función de la concentración de la proteína. Un declive positivo indica las acciones recíprocas repulsivas netas, mientras que un declive de la negativa apunta hacia las acciones recíprocas atractivas netas. La kD  obtenida de esta manera se puede entonces comparar a los valores del patrón2 A, usando las correcciones para el peso molecular, el coeficiente de la fricción, y el volumen específico.

Hemos observado diversos diversos anticuerpos en diversos estudios y hemos intentado correlacionar su kD con sus valores2 de A. Usando almacenador intermedio de la histidina, almacenador intermedio del citrato y almacenador intermedio del acetato, en diverso pH y en presencia del cloruro de sodio o del clorhidrato de la arginina, mostramos que un aumento en fuerza iónica lleva a un aumento en el K.D Esto, sin embargo, es pH-relacionado. En pH 5 no hay influencia del observable de la fuerza iónica, y los valoresD  de k son más altos que en pH 6. En pH que alcanza 4 las acciones recíprocas llegan a ser repulsivas. Esto se correlaciona a la carga en la molécula de proteína, significando que en el pH más inferior que está más positivo - cargado, y tenemos acciones recíprocas repulsivas más fuertes.

En muchos casos, kD también se correlaciona a la viscosidad. Hay casos sin embargo donde no hay correlación entre kD y la viscosidad, especialmente si la viscosidad consigue realmente alta.

kD se puede utilizar como parámetro para estudiar los anticuerpos y para entender su comportamiento en la alta concentración y cómo la viscosidad aumenta, aunque los estudios conducto en las concentraciones inferiores.

D ¿Cómo k es afectada por temperatura?

Es importante fijar los efectos de la temperatura sobre la propensión de una proteína a revelar y a agregar. Usando DLS podemos determinar la temperatura en la cual la proteína comienza a revelar, y ocurre- la agregación temperatura de la agregación (t)agg. Cuando la kD es más alta, la temperatura en la cual comienzo de la agregación es más alta porque estamos comenzando con acciones recíprocas más repulsivas. MAbs con un comienzo más inferiorD de k a revelar en una temperatura más baja y su propensión de formar los agregados es más alto. Así pues, una k más inferiorD significa un T. más inferior.agg Tales estudios nos ayudan a seleccionar la formulación más estable de un mAb determinado determinando que las condiciones están desestabilizando y que se estén estabilizando.

DLS puede convertirse en un método elogioso para los estudios temperatura-relacionados, soportar métodos típicos de la rampa de la temperatura como calorimetría de exploración diferencial (DSC). Puede también ser soportado por la temperatura UV-VIS en rampa, la fluorescencia, o el infrarrojo. Puede distinguir cómo los efectos difieren entre diversas secciones de una molécula. Por ejemplo, las áreas hidrofóbicas e hidrofílicas revelarán en diversas condiciones. Esto es especialmente importante para los mAbs como éstos comprende piezas fabulosas y de Fc distintas.

La investigación cambia al fabuloso y la pieza de Fc de los anticuerpos por separado, permite que usted aprenda más sobre la molécula. Con el cetuximab, un análisis detallado de DSC mostró que la parte fabulosa comienza a agregar tan pronto como comience a revelar, mientras que la pieza de Fc muestra dos diversas transiciones. La primera parte de despliegue ya comienza en las temperaturas bien abajo de 70 grados de C, pero no causa la agregación. La agregación se acciona solamente aproximadamente 75 grados de C, cuando el segundo despliegue comienza a ocurrir.

Agregando el análisis de DLS del cetuximab, podríamos ver que el diámetro hidrodinámico aumenta substancialmente mientras que sube la temperatura. Seguía habiendo el radio y la kD hidrodinámicos sin cambiar hasta cerca de 60 grados de C, el despliegue entonces comienza a ocurrir, y éste lleva a un cambio sustancial en el coeficiente de difusión. Significar que tenemos de pronto especie más grande, y una considerable disminución del K.D Esto significa que están ocurriendo las acciones recíprocas sustanciales entre las moléculas antes de que veamos la precipitación sensible. El comportamiento similar fue observado cuando la pieza de Fc fue estudiada por separado.

El análisis de DSC mostró que la parte fabulosa comenzó a agregar al principio de cualquier acción del despliegue. Sin embargo, una disminución de kD observada con DLS como el despliegue comenzó no fue acompañada por la precipitación sustancial. La agregación ocurre en las temperaturas más arriba de 80 grados de C.

La combinación de estudios reveló que la estabilidad conformacional de anticuerpos monoclonales es determinada por la carga neta debido a los efectos sobre acciones recíprocas atractivas y repulsivas electroestáticas. La estabilidad conformacional es así la más grande en más de gran alcalinidad, sin o con la sal, y también en un pH más inferior con la sal. el despliegue Temperatura-inducido es agregación accionada exponiendo los remiendos hidrofóbicos que median una reducción del K.D

D¿La tensión mecánica también afecta a k?

Como con la tensión térmica, la tensión mecánica, tal como sacudida y revolvimiento, puede hacer los agregados grandes formar. Semejantemente, la susceptibilidad a la agregación mecánico-inducida también es determinada por la formulación.

Hay una hipótesis que estas proteína-proteína-acciones recíprocas son importantes para la formación de estos agregados sobre la tensión mecánica. El estudio cerca él y otros mostró que con una k más altaD, la formación de la partícula sobre la tensión del mecánico y la formulación de un mAb fueron reducidas substancialmente, mientras que, si kD era igual a cero, había formación sustancial de la partícula. No hay, nos permite decir, una línea real de la correlación en eso, pero realmente le informa que la acción recíproca repulsiva puede llevar al hecho que, sobre la tensión de los mecánicos, tenemos menos agregación. Estudiamos eso.

Conducto la espectroscopia (IR) infrarroja en el interfaz del mAb y éste mostró que hay una formación de la película en el interfaz.  Evaluamos los espectros del IR, y son muy similares a lo que vemos en la solución. No podemos informar realmente si la proteína está revelada o no. No vemos un efecto del pH sobre los espectros del IR.

La microscopia del ángulo de Brewster mostró atados de la proteína dentro de la película. Usted podría incluso compararla al mar ártico en donde usted puede tener algunas corazas y flotadores del hielo en la diversa coraza del hielo, así que está recubriendo todo dentro de una película de la proteína.

La compresión de la película da lugar a una cierta formación del agregado o del atado. Cuando sacudimos hacia arriba el mAb, el pH cada vez mayor da lugar a una formación más fuerte de la partícula. kD disminuye con el aumento del pH. , Por lo tanto, tenemos esta correlación entre la formación de la partícula y el valorD de k que podemos medir para determinar la propensión para la formación global en el interfaz.

También utilizamos DLS para estudiar las conjugaciones del mAb y encontrar eso el introducir de una mitad hidrofóbica adicional hace las fuerzas atractivas pronunciadas y los valoresD de k disminuyen. El análisisD de k nos ayuda así a entender y a predecir el comportamiento de conjugaciones también.

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¿Puede usted resumir las conclusión dominantes?

En resumen, las mediciones de DLS y las mediciones2 de A en formulaciones del mAb proveen de nosotros la información en proteína-proteína-acciones recíprocas, particularmente, en las condiciones de almacenamiento. La A2 puede real ser un eslabón perdido en la agregación inducida interfaz de la temperatura y del mAb.

Las cargas netas repulsivas en el pH inferior aumentan la estabilidad coloidal, aunque una reducción de la estabilidad conformacional también fuera observada. La agregación fue impulsada por acciones recíprocas hidrofóbicas. El acoplamiento de cargas útiles hidrofóbicas diferentemente cargadas afectó a la estabilidad coloidal basada sobre todo en los efectos de la carga.

Sobre profesor Wolfgang Frieß

Profesor Wolfgang Frieß es profesor del producto farmacéutico y del biopharmaceutics en Luis Maximilians Universitaet Munich, Alemania. Un elemento clave de su investigación está investigando el eslabón entre el despliegue y la agregación térmicos de proteínas para ayudar a disminuir inestabilidades conformacionales y coloidales en formulaciones terapéuticas de las proteínas.

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